文献精读 | 肿瘤免疫治疗新靶点—MDSC免疫检查点c-Rel
一个小偷溜进某生物实验室，可从他进来，实验室里就一直有人，于是他找个角落等待他们下班。没想到走了一拨，又来了一拨，他坚持着。等到夜深人静，还有人做实验…他终于熬不住了，偷偷溜了出来。同伙见到忙问：“你待了那么久收获怎么样？”小偷苦笑道：“别说了，我学会提质粒了！”
撰稿 | 王青青教授课题组
近年来，肿瘤的免疫治疗作为一种创新的治疗理念，已成为目前及今后肿瘤综合治疗的重要手段。免疫治疗通过增强抗肿瘤免疫应答去识别和杀伤癌变细胞，不仅可有效清除手术无法完全清除或转移的肿瘤细胞，且特异性强，毒副作用远低于放化疗。2018年，抑制免疫负调控治疗肿瘤的研究成果被授予诺贝尔生理学或医学奖，将肿瘤免疫治疗的作用推向新的高度[1]。以PD-1/PD-L1为代表的T细胞免疫检查点抑制剂为多种癌症的治疗带来了新的希望[2]，但仍然存在很多问题，包括肿瘤微环境中复杂的免疫抑制因素，部分癌症患者很少甚至几乎没有肿瘤浸润T淋巴细胞等，限制了其疗效。
除了淋巴细胞，肿瘤局部浸润的固有淋巴样细胞[3]、髓系细胞[4]等细胞群体在调控抗肿瘤免疫应答的过程中发挥了十分重要的作用。肿瘤浸润髓系细胞参与免疫抑制微环境的形成，这些细胞在肿瘤中大量扩增，具有强大的免疫抑制功能并分泌促进肿瘤生长转移的介质，其数量与临床肿瘤进展及免疫治疗效果密切相关，近年来备受关注[5]。其中，髓系来源的免疫抑制细胞（Myeloid-derived suppressor cell, MDSC）是一群不成熟的髓系细胞，可通过表达高水平的精氨酸酶-1（Arginase, Arg1）、表面抑制性分子（如PD-L1）等抑制CD8+T细胞介导的特异性抗肿瘤免疫应答[6]。
c-Rel（也称Rel）是NF-κB家族中的一员，主要表达在髓系和淋巴系免疫细胞中。2020年5月18日，Nature Cancer杂志发表了来自宾夕法尼亚大学陈有海教授团队的研究成果：c-Rel is a myeloid checkpoint for cancer immunotherapy。该研究揭示了一种新的来自于MDSC的免疫检查点—c-Rel。结果显示，靶向MDSC中的转录因子c-Rel可逆转MDSC的免疫抑制能力，促进效应T细胞介导的抗肿瘤免疫应答，抑制肿瘤的生长[7]。
文章来源：
https://www.nature.com/articles/s43018-020-0061-3
逻辑路线分析
1. 髓系特异性缺失c-Rel，可显著抑制小鼠肿瘤的生长
作者首先对c-Rel全敲的小鼠，建立皮下黑色素瘤B16F10及淋巴瘤EL4模型，与WT小鼠相比，c-Rel缺失的小鼠，肿瘤生长明显减弱（Fig.1 a-b）。然而，以往的研究证实，c-Rel参与调控Treg[8]、Th17[9]细胞的发育过程。并且，Treg缺失c-Rel已被证实能抑制肿瘤生长[10]。为了探究MDSC和Treg分别对肿瘤生长的影响，作者利用Gr-1和CD25的抗体对MDSC和Treg进行删除，结果显示，与IgG对照组相比，虽然二者均能逆转c-Rel缺失导致的肿瘤生长抑制，但是MDSC删除后这种变化更加明显（Fig.1 a-e）。因此，作者利用Cre/loxP重组酶系统（LysM-cre）对小鼠髓系细胞的c-Rel进行条件性敲除，与前面的结论一致，髓系特异性缺失c-Rel的小鼠肿瘤生长得到明显的抑制（Fig.1 f）。
2. c-Rel调节MDSC的发育、功能和代谢
作者利用条件性c-Rel敲除小鼠(conditional KO，cKO)建立肿瘤模型，结果发现，当与WT小鼠肿瘤长到相同大小时，cKO小鼠肿瘤和外周血中的MDSC（CD11b+Gr-1+）的比例均有下降（Fig.1 g-h），并且活化的效应T细胞比例上升（Fig.1 i-j）。
Fig. 1 | Global and myeloid Rel gene deletion blocks tumor growth and reduces MDSCs in mice.
尽管MDSC的数目下降，但是依然有一定数量的MDSC存在，那这部分是否依然能有效抑制T细胞的功能呢？当肿瘤体积相同时，分选出MDSC与CD8+T细胞进行共培养，与WT MDSC相比，c-Rel缺失后的MDSC对T细胞的抑制能力明显减弱（Fig.2 a）。同时，作者利用IL-6和GM-CSF体外诱导骨髓来源的MDSC，也得到了相同的结论（Fig.2 b）。然而，作者注意到，当c-Rel缺失后，其代谢状态发生明显转变，与WT MDSC相比，KO的MDSC线粒体呼吸指标（OCR）下降（Fig.2 c-d），糖酵解指标（ECAR）明显上升（Fig.2 e），这种效应与Warburg效应相似，一般活化的促炎性免疫细胞会采取这种供能迅速的代谢方式，比如M1型巨噬细胞。
Fig. 2 | Reduced suppressive function and altered metabolism of Rel-/- Gr-1+ myeloid cells.
作者对WT和KO小鼠骨髓来源的MDSC进行RNA-seq，比较二者转录组的差异（Fig.3 a）。结果显示，Rel-/-MDSC促肿瘤的基因如：Arg1、Cebpb、Nos2等下调，这些基因大多富集在代谢通路（Fig.3 b-c）。而抗肿瘤的基因如Il1b、Tnfa、Il12p40等明显上调，这些基因大多富集在炎症反应（Fig.3d-g）。GSEA分析显示Rel-/-细胞失去了大多数MDSC的标志基因，他们的转录组更像中性粒细胞（Fig.3 h-i）。
Fig. 3 | Loss of MDSC gene signatures from Rel-/- myeloid cells.
作者随后在分选出的MDSC、体外诱导骨髓来源的MDSC中对测序结果予以验证，发现c-Rel的缺失导致C/EBPβ、Arg1的mRNA和蛋白表达均下降（Fig.4 a-c），而炎性基因的表达显著上调（Fig.4 d）。
3. c-Rel增强体（enhanceosome）特异性促进MDSC标志基因的表达
c-Rel作为一个重要的转录因子，是否会直接参与Cebpb和Arg1的基因转录呢？作者利用ChIP和Re-ChIP实验发现，c-Rel确实能激活Cebpb和Arg1基因的启动子（Fig.4 e-g）。在MDSC分化发育过程中，在响应GM-CSF的刺激0.5h后，c-Rel对Cebpb和Arg1的结合就显著增加，而其他转录因子C/EBPβ、p65、pSTAT3的结合要滞后于c-Rel（Fig.4 h-i）。然而，Re-ChIP实验显示，这些转录因子会形成单个增强复合体（Fig.4 j）。Co-IP实验也验证了c-Rel与NF-κB家族其他成员p65和p50的结合，但没有结合RelB（Fig.4 k）。
Fig. 4 | c-Rel activates the MDSC signature genes Cebpb and Arg1.
陈有海教授在2009年12月发表的Immunity文章[8]解释c-Rel对Treg发育调控和本文都提到了增强体（enhanceosome）这个概念。一个基因的转录可能由紧密增强子复合物形成的增强体控制，其中每个因子对转录是必不可少的。另外，也可能由多个模块化的增强复合物组成，其中每个因素不依赖于其他因子，各自发挥的转录调控作用成为总的转录输出，但这种模块化增强子复合物可能无法有效地作为基因表达或系谱分化“开和关”的控制。因为c-Rel的缺失就足以明显阻断MDSC标志性基因的表达，所以作者认为c-Rel通过增强体形式调控MDSC基因的表达。GM-CSF、IL-6、c-Rel、C/EBPβ、STAT3和NFAT6等因子都参与了MDSC的发育，但这些基因不是MDSC特异性的。与其他增强体一样，含c-Rel的增强体也是作为“coincidence detectors”运作的，只有当所有的增强体因子都存在靶基因位点时（无论是按顺序地或同时），c-Rel的靶基因才会转录，缺少其中任何一个都无法进行，这是MDSC发育过程中转录调控的特异性[11-13]。
c-Rel作为NF-κB家族的一员，通常被认为参与调控炎症的发生，然而，c-Rel缺失的MDSC反而获得了促炎的表型。作者利用LPS去刺激WT与KO的骨髓来源巨噬细胞（BMDM），发现c-Rel缺失的巨噬细胞，在响应LPS刺激后，Il-1b和Il12p40的表达显著降低，作者推测这可能是细胞类型或者谱系特异性带来的差异。在BMDM中，在炎性基因Il12p40启动子区域很容易检测到c-Rel（Fig.5 a），而即便在IL-6和GM-CSF刺激后的MDSC中，c-Rel也不能在Il12p40启动子区域检测到（Fig.5 b），这提示了c-Rel对MDSC和BMDM的Il12p40基因可接近性是不同的。c-Rel缺失的MDSC中炎性基因的上调是因为控制MDSC发育的关键转录因子C/EBPβ表达下降，作者对c-Rel缺失的MDSC过表达Cebpb后，发现能恢复下游基因的表达水平（Fig.5 c-h），增强线粒体呼吸，减弱糖酵解，对T细胞抑制能力增加（Fig.5 i-l）。
Fig. 5 | c-Rel regulates MDSC gene expression, metabolism and suppressive function via Cebpb.
4. c-Rel的抑制剂R96A能抑制肿瘤生长并增强PD-1抗体的疗效
陈有海教授团队曾经开发出c-Rel抑制剂R96A，在R96A给药后，发现能显著减弱小鼠黑色素瘤和淋巴瘤的生长（Fig.6 a-c），而这个效应在c-Rel全敲小鼠中是看不到的（Fig.6 d），证明这是c-Rel依赖的肿瘤抑制过程。并且，使用抑制剂后，确实能减少MDSC的产生、减弱对T细胞的抑制能力。另外，作者同时利用PD-1的单抗进行对照实验，发现R96A的抗肿瘤效应与PD-1抗体的效应相近并且二者联用有明显的协同增强效应（Fig.6 e-f）。
Fig. 6 | c-Rel inhibitor blocks tumor growth and MDSC development, and enhances the effect of anti-PD1 therapy.
5. c-Rel的抑制剂R96A能够减弱人源MDSC的免疫抑制功能
作者最后取人外周血单个核细胞（PBMC），利用IL-6和GM-CSF体外诱导成MDSC，在R96A处理后，MDSC对T细胞的免疫抑制能力显著下降，并且，Arg1和C/EBPβ的mRNA表达也明显下降。这提示了c-Rel的抑制剂有望作为髓系免疫检查点，成为新一代肿瘤免疫治疗的有效手段。
Fig. 7 | c-Rel inhibitor blocks human MDSCs.
最后，c-Rel抑制剂R96A虽然在体外实验看到显著的抗肿瘤效果，但是它在淋巴细胞和髓系细胞表达，并且对炎症反应的调控具有细胞类型特异性，因此，与现有的免疫治疗手段类似，需要密切关注它的安全性，即在激活抗肿瘤免疫应答时，是否会因为炎症因子过度表达，甚至产生细胞因子风暴导致组织损伤，是否引起自身免疫疾病，这些都需要在临床试验中重点关注。
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【参考文献】
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