编译：不二，编辑：十九、江舜尧。
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导读
原肠胚三个初始胚层的形成是建立脊椎动物身体发育必不可少的步骤，并且与主要的转录变化相关。这些变化伴随着表观遗传重编程，但是表观基因组在调节早期细胞命运的作用仍未得到解决，并且不同胚层之间的分子相互作用尚不清楚。本研究描绘了在小鼠原肠胚发生过程中染色质可及性、DNA甲基化和RNA表达的单细胞多组学图谱。多能性的起始与整体抑制性的表观遗传的建立一致，随后在原肠胚发生中出现了细胞谱系特异性的表观遗传模式。值得注意的是，位于中胚层和内胚层的细胞在增强子标记处经历了广泛的协同表观遗传重排，这是由TET（ten-eleven translocation）介导的去甲基化和可及性增加。相比之下，外胚层细胞的甲基化和可及性已在早期表皮细胞中建立。因此，在决定细胞命运之前，每个胚层相关的调控元件在表观遗传上活化或重塑，从而为初始胚层的分层出现提供了分子框架。原名：Multi-omics profiling of mouse gastrulation at single-cell resolution
译名：在单细胞分辨率下对小鼠原肠胚的多组学分析
期刊：Nature
IF：43.07
发表时间：2019.12
通讯作者：Oliver Stegle，John C. Marioni 和 Wolf Reik
通讯作者单位：欧洲生物信息学研究所（EMBL-EBI）和英国巴布拉汉研究所
DOI号：10.1038/s41586-019-1825-8
小鼠胚胎样本：本研究使用的是C57BL/6Babr品系小鼠，母鼠怀孕E4.5-E7.5时收集胚胎，每个胚层至少获得50个细胞。
Tet TKO细胞培养：Tet1−/−、Tet2−/−、Tet3−/−及野生型ES细胞的胚体分别在分化后第2、4、5、6和7天收集。
测序数据：样本制成单细胞悬液，分配到96孔PCR板中，构建测序文库，使用NextSeq500平台分别进行单细胞测序（scRNA-seq）和单细胞核小体甲基化组和转录组测序（scNMT-seq）。ChIP-seq数据下载与GEO数据库（GSE125318.）。
生物信息学分析：测序数据经过质控和过滤后，比对到小鼠参考基因组（GRCm38）上。进行基因注释和定量，以及甲基化和可及性定量。对RNA表达数据进行细胞谱系鉴定，对RNA表达和启动子表观遗传状态进行相关性分析，对DNA甲基化和染色质可及性进行差异分析。对多组学数据进行多组学因子分析（MOFA）。
多能性起始的表观基因组动态
研究了每个过渡阶段中DNA甲基化和染色质可及性的变化。在胚胎组织中整体甲基化水平从约25％增加到约75％，在胚外组织中增加到约50％，这主要是由从E4.5到E5.5的de novo甲基化所引起的，并优先针对CpG-poor的基因组位点（图1e）。相比之下，我们观察到整体染色质可及性从E4.5的约38％逐渐下降到E7.5的约30％（图1f），胚胎组织和胚外组织之间没有差异。为了将每个阶段的表观遗传学变化与转录动态联系起来，我们对每个基因和每个胚胎细胞进行了RNA表达与启动子上相应的DNA甲基化或染色质可及性之间的相关性研究。在测试的5000个基因中，我们鉴定了125个基因的表达与启动子DNA甲基化显著相关，而52个基因的表达与染色质可及性显著相关（图1g）。这些基因座位主要由早期多能性和胚层细胞的标记基因组成，例如Dppa4、Zfp42、Tex19.1和Pou3f1（图1g，h），这些标记基因受到抑制，与整体甲基化的增加和可及性的减少相吻合。此外，该分析还鉴定了可能在发育中发挥未知作用的基因，包括Trap1a和Zfp981。值得注意的是，在E4.5之后被上调的基因中，只有39个和9个基因分别显示出RNA表达与启动子甲基化或可及性之间的显著相关性。这表明这些基因的上调可能受其他调节元件控制。
为了了解胚层中所有三个分子层之间的关系，研究者接下来将多组学因子分析（MOFA）应用于E7.5的细胞。MOFA跨多个数据模式同时执行无监督的降维，从而通过少量的推断因素来捕获细胞间变异性的整体来源。值得注意的是，该模型利用了来自相同细胞的多元测量，检测了不同数据模式之间的协同变化。使用蛋白编码基因的RNA测序（RNA-seq）数据以及预测的调控元件的DNA甲基化和染色质可及性数据，作为模型的输入数据。这包括对远端H3K27ac（增强子）和H3K4me3（转录起始位点）的启动子和胚层特异性染色质免疫沉淀的DNA测序（ChIP-seq）。MOFA鉴定了六个因子，前两个因子捕获了三个胚层的出现（图2a，b）。值得注意的是，MOFA将基因表达水平的变异与细胞谱系特异性增强子标记的甲基化和可及性变化联系起来（图2c）。相比之下，在启动子或H3K4me3标记区域的表观遗传变化与胚层形成显示出非常弱的相关性（图2a）。这支持了其他研究将远端增强子作为细胞谱系驱动的调控区域。基因与增强子相关性分析鉴定了关键胚层标记基因相关的增强子，这些标记基因包括Lefty2和Mesp2（中胚层）、Foxa2和Bmp2（内胚层）以及Bcl11a和Sp8（外胚层）（图2c）。值得注意的是，外胚层特异性增强子比中胚层和内胚层特异性增强子显示出更少的相关性，这一发现将在下面进一步探讨。其余四个因子对应于与前后轴模式（因子3）、脊索形成（因子4）、中胚层模式（因子5）和细胞周期（因子6）相关的其他转录和表观遗传学特征。最后，鉴定了可介导或响应胚层表观遗传变化的转录因子。将差异表达信息与在不同可及性基因座位的motif富集整合在一起后发现，细胞谱系特异性增强子富集了与关键发育转录因子相关的结合位点，包括外胚层的POU3F1、SOX2和SP8，内胚层的SOX17、HNF1B和FOXA2，以及中胚层的GATA4、HAND1和TWIST1（图2d）。
图2 MOFA分析揭示了胚层中增强子协同的表观遗传和转录组变异。接下来，研究了与特异胚层相关的表观基因组模式在发育过程中的产生过程。内胚层和中胚层中的增强子DNA甲基化水平与全基因组动态一致，在所有细胞类型中从平均25％增至80％（图3）。在细胞谱系特异性方面，它们以细胞类型特异性方式协同去甲基化至约50％。染色质可及性观察到相反的模式，中胚层和内胚层中的增强子可及性最初从大约40％降低到30％，而细胞谱系特异性的可及性升至约45％。因此，在斑马鱼、爪蟾和小鼠胚胎发生过程中，增强子的去甲基化和染色质打开的整体动态是保守的。与这些数据一致，在量化分化程度更高的组织（E10.5中脑、E12.5肠和E10.5心脏）中细胞谱系增强子的H3K27ac水平时，研究人员观察到大量增强子被H3K27ac标记。这表明增强子在E7.5建立，并将在很大程度上得到保持。与中胚层和内胚层增强子相反，外胚层增强子早在E4.5的表皮细胞中就已打开并去甲基化（图3）。在中胚层命运的细胞中，外胚层增强子才被部分抑制。当检测包含外胚层转录因子（SOX2和SP8）的motif位点的可及性动态时，研究发现这些motif已经在表皮细胞中可及，并且由于中胚层的参与而失去可及性。相反，与内胚层和中胚层转录因子相关的motif只有在E7.5时才能在其各自的细胞谱系中可及。这些结果可以通过在外胚层中活化外胚层标记基因或在外胚层中维持多能性标记基因来解释。为了对此进行研究，将E7.5的增强子注释与已报道的胚胎干细胞（ES细胞）和E10.5中脑的H3K27ac ChIP-seq数据进行重叠。E7.5外胚层增强子显示出几乎所有的多能或神经信号，并具有明显不同的DNA甲基化和染色质可及性动态。多能性增强子显示甲基化增加，可及性随时间降低，这表明这些增强子的抑制与多能性基因启动子的动态相似（图1g，h）。相比之下，神经外胚层增强子从E4.5保持低甲基化及可及性状态。最后，为了推断增强子激活的时间依赖性，使用RNA表达谱对中胚层和内胚层的两条细胞轨迹进行排序。通过绘制每类细胞谱系增强子的平均DNA甲基化和染色质可及性，发现外胚层增强子的甲基化增益（和可及性丧失）先于中胚层和内胚层增强子的去甲基化（和可及性增益）。在这两种情况下，同时发生甲基化和可及性的变化，表明两个表观遗传胚层的紧密调控。
图3 发育过程中的细胞谱系增强子的DNA甲基化和染色质可及性动态。TET甲基胞嘧啶双加氧酶已被报道与增强子的去甲基化有关，功能丧失实验表明TET酶对于原肠胚形成至关重要。为了检测TET酶是否介导细胞谱系特异性去甲基化，研究者将野生型ES细胞和所有三种TET酶（Tet TKO）敲除的ES细胞都分化成胚体，并使用单细胞核小体甲基化组和转录组测序（scNMT-seq）分析了这些细胞。将RNA表达图谱映射到体内原肠胚图谱，显示野生型胚体概括了从分化第2天的多能表皮细胞向第4天到第5天之间的原条的过渡（图4a，b）。在第6和第7天，观察到了成熟的中胚层结构的出现，包括造血细胞类型（图4a，b）。标记基因在预期的细胞谱系中表达，细胞谱系之间的差异表达与体内结果相符。此外，野生型胚体中DNA甲基化和染色质可及性的整体动态基本反映了体内数据。在第2天，在表皮样细胞中Tet TKO分化与野生型的比较，显示Tet TKO细胞中外胚层增强子较高的DNA甲基化，但中胚层或内胚层增强子无差异（图4c）。Tet TKO胚胎的甲基化的重新分析证实了在体内观察到相同的模式。去甲基化的受损还与分化时间的差异有关，Tet TKO细胞在第4至5天显示出早期中胚层分化的比例增加（图4a，b）。然而，在第6至7天，Tet TKO细胞不能适当地去甲基化细胞谱系特异性增强子，也不能分化为成熟的中胚层细胞类型（图4c）。这些结果表明，细胞谱系增强子的去甲基化至少部分地由TET酶介导。尽管早期中胚层似乎不需要增强子去甲基化，但是Tet TKO细胞中缺乏造血细胞表明去甲基化对于随后的细胞谱系发育可能是重要的。Tet TKO胚胎能够启动原肠胚形成，但是它们在E8.5中胚层衍生的细胞类型（包括心脏或体节）中显示出缺陷。
图4 TET酶是中胚层增强子的去甲基化以及随后胚体血细胞分化所必需的。
研究结果表明，多能表皮细胞早在E4.5时就被表观遗传的外胚层活化。这一发现支持了Waddington等人的表观遗传模型中“默认”路径的存在，为ES细胞的神经外胚层组织“默认”分化的现象提供了潜在的机制。相比之下，内胚层和中胚层通过相应增强子的去甲基化和染色质打开而主动地偏离默认路径。因此，胚层表观基因组是在原肠胚中通过分层或非对称表观遗传模型界定（图3a）。
总之，这些结果对表观基因组在细胞谱系中的作用具有重要意义。可推测，不对称的表观遗传活化以及早期祖细胞被表观遗传默认的细胞类型活化可能是体内细胞谱系的一个更普遍的特征。与这一假设一致，最近的两项研究鉴定了前肠和成骨的默认信号通路。未来使用多组学方法研究细胞群体的研究有可能改变我们对细胞命运的理解，这对干细胞生物学具有重要意义。
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