编译：思越，编辑：夏甘草、江舜尧。
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导读
RAS基因是最常见的人类致癌突变基因之一，KRAS亚型发生的突变率最高。然而，从最初发现至今的30多年里，还没有一款直接针对KRAS突变的靶向药物。经过多年的努力，KRAS G12C突变抑制剂的发现，为近10-12%的晚期非小细胞肺癌（NSCLC）患者提供了有效的靶向治疗。这篇综述主要报告了KRAS突变检测的现状，总结了NSCLC中抑制KRAS的生物学基础，并讨论了最新的治疗策略的概述与临床实践中新的靶向药物所面临即将到来的挑战。
原名：KRAS inhibition in non-small cell lung cancer: Past failures, new findings and upcoming challenges
译名：在非小细胞肺癌中抑制KRAS突变：过去的失败，新的发现和未来挑战
期刊：European Journal of Cancer
IF：7.275
发表日期：2020年6月18日
通讯作者：Silvia Novello
通讯作者单位：都灵大学医学院
DOI号：10.1016/j.ejca.2020.06.023
1.NSCLC中的KRAS突变
KRAS是人类癌症中普遍出现的癌基因，30%的肺腺癌中都会发生。与其他非小细胞肺癌的分子改变（如EGFR突变和ALK重排）不同，KRAS突变主要发生在西方人群和吸烟人群中。KRAS负责编码21kD大小的GTP酶，一种将GTP分子转换成GDP的蛋白。因此，KRas如同一个开关：当KRas传递信号时，其需要与GTP分子进行结合来进入激活状态；而当GTP转换成GDP时，KRas蛋白便会进入失活状态，停止传递信号（图1）。KRAS 的外显子2,3,4突变会引起MAPK通路的激活，且在NSCLC中，约90%的等位基因突变发生在第2个外显子的第12位密码子上，并以G12C和G12V最常见。KRAS的生物学活性与其结构有关，并取决于GTP分子结合的状态，12，13，61，117，146位密码子上的KRAS激活突变位于核苷酸结合口袋结构周围，且密码子G12的突变位于P-loop区，这个区域与激活步骤中的核苷酸稳定有关，引起固有GTP水解和GTP酶激活蛋白诱导水解的改变（图2）。最近的研究发现，KRAS突变常常与肺癌中共同发生的基因组改变有关，NSCLC中约一半的KRAS突变伴随着重要癌基因的改变，如TP53，STK11，Keap1和CDKN2A/B，成为肿瘤细胞固有的RAS信号和肿瘤微环境(TME)免疫组分的重要因素，从而进一步促进了非小细胞肺癌的分子和临床异质性，例如KRAS/TP53双突变肿瘤与免疫微环境有关，表现为PD-L1高表达、高肿瘤负荷以及高密度CD8+T细胞浸润，而KRAS/STK11/KEAP1共突变肿瘤通常表现为PD-L1低表达、低密度CD8+T细胞浸润。总之，KRAS突变型非小细胞肺癌是一种异质性疾病，需要以其不同的分子特征进行分型，并进一步归纳其生物学行为并做出临床决策。
图1 RAS细胞信号通路
图2 KRAS突变分布
2.KRAS突变检测现状
目前，意大利卫生系统批准的分子标志物包括EGFR、ALK、ROS1、PD-L1和BRAF。到目前为止，针对NSCLC的KRAS突变检测尚未被批准作为治疗选择的分子标志物，但截止2019年，约68%的转移性非鳞状非小细胞肺癌患者进行了KRAS突变检测。在大多数临床中心，KRAS 突变分析与 EGFR 检测同时进行，并产生详细的分子报告，包括外显子、密码子和特定类型的突变。用于评估KRAS突变的最常用的方法是二代测序，其次是Sanger测序和RT-PCR。在绝大多数的临床中心，会部分补偿KRAS突变分析的费用。作者调查了在意大利的4个胸部恶性肿瘤研究中心的患者KRAS突变在NSCLC的分布情况，结果显示，2019年新诊断的肺腺癌转移患者中检测到 212个存在KRAS 突变(27.6%)，G12C和G12V 是最频繁的突变，分别占 KRAS 总突变的43% 和17% 。检测人群中发现的其他突变包括G12D (2.9%)、G12A (2.2%)、G13C (1.2%)、G13D (0.9%)、Q61H (0.9%)、G12R (0.5%)、G12S (0.4%)和Q61L (0.3%)（图2）。二代测序在意大利得到了应用，但是仍然局限于大型分子病理学实验室，由于检测的平台和技术差异导致不同的突变率和特定的变异分布。随着靶向G12C的药物出现，考虑到 NSCLC 患者临床相关标志物数量的不断增长（包括EGFR、BRAF、 KRAS和MET-14外显子跳跃，以及ALK、ROS1、RET和NTRK融合），分子诊断方法的标准化是意大利等多数欧洲国家需要解决的关键挑战。
3.治疗策略与临床证据
3.1 间接靶向KRAS策略
过去的很长时间KRAS都被认为具有“无法成药”性，因为其对GTP分子的高度亲和力，且细胞中GTP浓度很高，这让直接靶向KRAS的GTP结合位点的抑制剂很难生效；此外，KRAS蛋白表面平滑，具有近乎球形的空间结构，缺乏较深的疏水口袋，阻碍了高亲和力变构抑制剂的识别。因此，开发KRAS的下游抑制剂及表观遗传的方法可能是备选的治疗策略（表1）。
3.1.1 下游抑制剂
RAF/MEK/ERK是KRAS的下游通路，该通路的靶向抑制剂已经在临床试验中进行了研究。但是，患者使用MEK抑制剂selumetinib和trametinib未能显示出任何生存改善，其原因可能是低估了RASs突变异构体、KRAS突变特定等位基因或共生突变所产生的异质性，进而影响靶向治疗的疗效；也有学者认为可能是MEK抑制剂激活了RAS下游的其他适应性抵抗信号通路；此外KRAS的二聚化可能也会产生抵抗性。有研究发现，MEK的抑制会上调KRAS突变肿瘤中的局部黏着斑激酶FAK活性，相比于单独使用FAK抑制剂defactinib，在10名非小细胞肺癌患者中联合使用RAF/MEK抑制剂VS-6766具有90%的疾病控制率 (DCR)，并且在G12V突变患者中的缓解率更高。PI3K/AKT/mTOR通路也是KRAS下游信号通路的一部分，参与代谢控制、免疫、血管生成和心血管内稳态过程，抑制PI3K/AKT/mTOR通路可能会在KRAS突变治疗中起作用，但是研究发现PI3K/AKT/mTOR抑制剂对NSCLC的治疗效果有限，泛PI3K抑制剂buparlisib对12名复发的KRAS突变NSCLC患者显示出更长的无进展生存期(PFS)，mTOR抑制剂ridaforolimus可以阻止KRAS突变NSCLC小鼠和临床前模型的恶性进展，但在临床试验中仅有1%的客观缓解率（ORR）（表1）。
3.1.2 表观遗传学方法
研究发现，KRAS突变可以通过激活RAS/MEK通路增加端粒酶活性和端粒长度，抑制端粒酶可降低KRAS突变引起的肺部肿瘤生长和化疗耐药。靶向端粒/端粒酶可能是治疗KRAS突变的有效方法，但一项端粒酶抑制剂imetelstat的II期临床试验未能改善一线化疗的晚期NSCLC患者无进展生存期(PFS)，仅有小部分非KRAS突变的端粒长度较短的患者，PFS和总生存率(OS)有改善的趋势。一项使用腺病毒KRbz-ADV靶向NSCLC模型的第12位密码子的研究发现，注射KRbz-ADV后，在体内和体外能够抑制胰腺癌的生长并特异性地切割突变体。同样，一项研究使用RNA干扰技术敲除突变的转录本后，KRAS的表达受到抑制且细胞增殖减少，但致瘤性没有完全消失。这些发现证实了KRAS致癌信号非常复杂，对于靶向沉默NSCLC患者KRAS突变的临床应用仍需进一步研究。染色质修饰剂如组蛋白去乙酰化酶抑制剂(HDACi)也可以阻断KRAS信号通路，抑制基因转录并诱导肿瘤细胞凋亡。在KRAS突变的NSCLC A549细胞系中，使用抑制剂panobinostat减少了细胞增殖。有关MEK和HDAC抑制剂联合使用的研究发现对RAS突变肺癌细胞的代谢活性具有协同抑制作用。一项II期临床试验的研究发现，初治患者联合使用卡铂与紫杉醇与HDACi伏立诺他具有更高的缓解率和总生存期，提示多重药理阻滞可作为特定人群RAS基因突变的肺癌患者的新的治疗策略（表1）。此外，翻译后修饰对KRAS的致癌活性也具有重要作用。KRAS最初被合成为存在于胞质的无活性蛋白质，为了使KRAS在翻译后变得活跃，KRAS要经过多阶段的修饰，首先就是法尼基转移酶（FTase）催化的法尼基部分与CAAX序列的半胱氨酸残基的共价加成。这些过程为FTase抑制剂(FTI)的研究提供了依据。FTI的体外研究表明，其在各种癌症小鼠模型中可有效阻断HRAS驱动的癌细胞生长。两种抑制剂（lonafarnib和tipifarnib）已进入III期临床试验，并在具有KRAS突变（胰腺癌、结肠直肠癌和肺癌）的癌症中进行了测试，但不幸的是所有FTI在具有高频KRAS突变的肿瘤中没有活性，其原因可能是不同的KRAS突变亚型、突变特异性等位基因或共生突变的出现。此外，小分子化合物（如salirasib）是法尼酰基-半胱氨酸类似物，可竞争KRAS在细胞膜上的结合位点，使KRAS蛋白从细胞膜上脱离从而更易被降解。在临床前研究中虽然salirasib抑制了A549细胞的KRAS 活性，但临床试验结果并不显著。
3.2 直接靶向KRAS
随着对KRAS生物学的进一步了解以及新技术的诞生，可以识别到以前无法识别的药物口袋结构和靶向域，引起了人们对直接抑制特定RAS突变等位基因的兴趣。其中，选择性靶向 KRAS G12C 突变的小分子药物研究是目前最被看好的。G12C亚型具有特殊的晶体结构，并对半胱氨酸硫醇具有独特反应性，能够在邻近核苷酸的结合口袋区域共价结合半胱氨酸残基。2013年Shokat报道了靶向KRAS G12C突变的可能性，他们筛选设计的活性小分子能够在G12C处不可逆地与突变体半胱氨酸结合到KRAS效应区附近的一个小口袋。结合到这个口袋的小分子可以通过将蛋白质锁定在GDP结合的非活性状态来抑制KRAS活性。KRAS小分子抑制剂ARS-1620，在细胞及动物模型上验证了靶向KRAS G12C的可行性，表明KRAS G12C结合的核苷酸处于动态平衡状态，而靶向低活性的GDP结合形式是可行有效的方法。Canon等人鉴定出高活性高选择性的分子AMG 510，在临床前模型中使用后观察到细胞增殖停滞和肿瘤消退，接受AGM510治疗的4名肺癌患者中，六周后有两名患者的癌肿出现萎缩，并开展了34名携带KRAS p.G12C突变的转移性非小细胞肺癌患者的I期临床试验，初步结果已在2019年美国临床肿瘤学会会议上公布，随后在2019年世界肺癌会议上进行了更新。AMG510具有可观的有效性和安全性，在23名评估肿瘤反应的患者中，疾病控制率（DCR）达到96%，有效率达（ORR）到48％，没有发现剂量限制毒性和与药物有关的4级以上不良反应。目前，AMG 510正在进行II-III期临床试验。同样地，另一种选择性KRAS G12C小分子抑制剂MRTX849显示出非常强大的抗肿瘤活性，在多种肿瘤的KRAS G12C阳性的细胞系源性和人源性异种移植模型中，MRTX849使得65%的肿瘤缩小，进入I期临床试验。在接受最大剂量600mg（bid）的6例可评估疗效的NSCLC患者中3例产生应答（肿瘤缩小30%以上），4例结直肠癌患者中，有1例产生应答（表1），且耐受性较好，大部分患者仅有腹泻、恶心、呕吐、AST升高等I级不良反应。此外，泛KRAS抑制剂可以抑制多种G12和G13 KRAS基因突变型肿瘤的生长，但由于缺乏对RAS蛋白活性形式与非活性形式以及脱靶活性的区分，导致严重的体内毒性。最近，国际分子靶标与癌症治疗学会议上(EORTC-NCI-AACR)公布了包括BI 1701963新型口服泛KRAS抑制剂的极具前景的临床前研究数据，BI 1701963通过与SOS1结合来抑制KRAS，并对存在KRAS基因突变的癌细胞系具有选择性。基于这些研究结果，BI 1701963已推向I期临床试验。
3.3 免疫检查点
肿瘤细胞内源性 RAS 信号通路与不同的免疫调节作用有关，包括调节 PD-L1的表达、 cd8+淋巴细胞浸润和肿瘤微环境中髓系抑制细胞的密度，影响免疫逃避和转移过程。细胞周期蛋白依赖性激酶（CDK）参与调节细胞周期，所以以CDK4/6为靶点的抑制剂成为新一代的抗肿瘤药物。CDK4/6在动物基因学实验中显示与Kras变异肺癌有合成致死，即Kras变异肿瘤细胞失去CDK4/6后增殖受阻，但野生Kras肿瘤细胞无此现象，且abemaciclib和palbociclib的疗效欠佳，阻碍了下一步的临床研究。但是，多种靶向治疗策略结合的方式（如CDK4/6和MEK抑制剂）正在进行下一步的临床试验。SHP2是由PTPN11基因编码的一种非受体型蛋白酪氨酸磷酸酶，参与包括细胞增殖、活化、迁移、分化等重要的细胞生命活动。SHP2介导的RAS-MAPK信号激活及其对JAK-STAT信号的负调控作用使得SHP2成为致癌或抑癌信号通路的重要参与者。RMC-4630和 TNO155都是新型有效的选择性的SHP2小分子变构抑制剂，RMC-4630的I期临床试验结果显示，药物具有良好的耐受性和活性，疾病控制率（DCR）达到 67%，对于G12C亚型可达到75%。此外，有关RMC-4630和 TNO155与MEK抑制剂cobimetinib、PD-1抑制剂spartalizumab或CDK4/6抑制剂riociclib的联合应用都已进入临床试验阶段（表1）。
表1 晚期NSCLC患者靶向KRAS突变的治疗策略总结
KRAS并不是一个无法成药的靶点，KRAS 在肺癌患者的治疗抑制中有着很大的作用。由于过去几十年对KRAS生物学作用的理解有限以及对结构蛋白生物化学技术壁垒，导致对KRAS的研究十分曲折。技术的进步加深了对RAS生物学的了解，并识别出药物口袋结构，并强调了分子亚型在靶向治疗中的作用。在目前正在进行临床研究中，通过小分子抑制剂直接靶向KRAS G12C亚型已成为临床上最有希望的方法。在今后的研究中，普及NGS检测平台以提高样本的分子诊断准确性，为NSCLC患者选择有效的生物标记物，寻找KRAS其他突变亚型的治疗方法，都是接下来要面临的挑战。
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