21088 抗体的结构和功能

Chiu ML, Goulet DR, Teplyakov A, Gilliland GL. Antibody Structure and Function: The Basis for Engineering Therapeutics. Antibodies (Basel). 2019;8(4).

Janssen Research & Development, University ofWashington

导读：此文献是2019年发表的一篇综述，英文PDF篇幅长达80页，包括了50页正文和30页引用文献（605篇）。非常详细地介绍了抗体的结构和功能，值得抗体相关行业人员收藏细读。本文仅是原文献内容的概述，详细内容请阅读原文。

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摘要

抗体和抗体衍生的大分子已经成为以蛋白质为基础的治疗分子(生物制剂)的支柱。作者对抗体的结构-功能关系的了解为蛋白质工程提供了一个平台，蛋白质工程已被开发用于产生各种治疗适应症的生物制剂。本篇综述中描述了作者对抗体结构的基本理解，以及如何利用这些知识研究抗体工程和具有抗原亲和力、效应功能和生物物理特性的抗体相关制剂。这些平台包括抗体、抗体片段、双特异性抗体和抗体融合产品的开发，这些产品的效力和可生产性可以通过人源化、亲和调节和稳定性增强来提高。作者还回顾了结合臂的设计和选择，以及热调节。本文包括了制备双特异性和多特异性分子用于一系列治疗应用的不同策略。

1. 引言

目前，所有用于广泛治疗适应症的抗体和抗体衍生的大分子都需要蛋白质工程。正在使用的工程方法是基于我们对蛋白质结构的知识，尤其是我们对这些结构如何与其功能相联系的知识。我们对抗体的三维结构的了解是从20世纪70年代开始的许多实验室的晶体学研究报告中获得的。目前，蛋白数据库(PDB)包含超过3500个抗体片段(Fab、Fvs、scFvs和Fcs)的结构，以及少量完整的抗体结构。结构数据包括这些分子与蛋白质、其他大分子、多肽和半抗原的复合物。

人体免疫球蛋白是由两条相同的轻链(LCs)和两条相同的重链(HCs)组成的Y型蛋白质。在自然系统中，一个LC与一个HC配对，与另一个相同的异二聚体结合，形成完整的免疫球蛋白。异质二聚体的HC和LC通过二硫键连接。异四聚体的两个碳氢化合物也通过二硫键连接。人类LCs可以是两个功能类似的类之一，κ或者λ。两个LC类都有两个域，一个恒定域(CL)和一个可变域(VL)。相比之下，人类抗体HC可以是五种同型之一，IgA, IgD, IgE, IgG,和IgM，每一种在调节免疫系统中都具有单独的作用。

• IgA, IgD和IgGs有三个恒定域(C)和一个可变域(V)。

• IgEs和IgMs有一个可变域和4个恒定域。

• IgA和IgM同型物具有额外的J链，能够分别形成二聚体和五聚体。另一个同型物则是单体的。

下面所描述的抗体的一般特征将集中在IgG1框架上。我们对抗体结构与功能之间关系的了解正在被用于制造具有适当功能和生物物理特性的抗体和抗体相关生物制剂，以满足特定的治疗需求。应用于抗体、抗体片段、抗体和抗体融合产品的工程方法包括效应器功能工程、抗体人源化、亲和调节和稳定性增强，以提高疗效和可制造性。

1.1 免疫球蛋白的总体特征

图1所示的完整抗体分子有三个功能成分，两个片段抗原结合域(Fab)和片段结晶域(Fc)，两个Fab通过铰链区连接到Fc，这使得Fab相对于Fc有很大程度的构象灵活性。每个Fab都有相同的抗原结合位点来结合特定的目标抗原。Fab的Fv区域由一对由HC和LC贡献的可变域(VH和VL)组成。相比之下，糖基化Fc区域与多种受体分子结合，提供效应器功能，从而决定抗体如何与体液免疫系统的其他组成部分相互作用。

图1. 完整的IgG分子结构。蛋白数据库(PDB) id: 1igt，是小鼠IgG2a的同型。轻链是绿色的，重链是青色和蓝色的，聚糖是橙色的棒状物，链间二硫化物是黄色的棒状物。

所有重链和轻链的结构域长度大约为110个氨基酸残基，其构象被称为免疫球蛋白折叠(图2)。

1.2 Fab区域

1.2.1 Fab整体特征

免疫球蛋白的Fab区是由LCs的VL和CL与HC的VH和CH1配对形成的。VL和VH配对，形成抗原结合位点。两个β折叠由β链C C C F B聚集在一起，形成一个桶状结构，连接环对齐(互补决定区域或CDR，见下文)，并形成抗原结合位点。相比之下，CH1和CL结构域利用相反的A B E D β-折叠的互补面以几乎垂直的方式紧密堆积。

Fab的HC域和LC域的总体布局以所谓的肘弯或肘弯角为特征。这是由连接两对域(VH, VL和CH1, CL)的伪双重轴之间的角度定义的。早期对带有kappa (κ)轻链的Fabs的调查显示，夹角从116到226不等。具有lambda (λ)轻链的Fabs有更宽的角度范围，表明更高的柔性水平。这可能是由于在λ LCs的开关区域存在一个额外的氨基酸残基(通常是一个甘氨酸)。

1.2.2 Fab抗原结合位点

抗原结合位点是由Fab VH和VL与N端区域配对形成的Fv区域。如图3所示，对于VL，每个域对VH, CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3贡献了三个互补决定区域CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，

1.2.3 结合与亲和的关系

抗体的抗原结合常常导致抗体和抗原接触面的构象变化。这些事件已经被许多实验室在抗体片段(Fabs或Fvs)单独和与抗原复合物的结构确定中详细研究。在讨论抗原抗体相互作用时，一般的结合模式被引用为:锁和钥匙，诱导匹配，构象选择。抗体结合可以依赖于抗原的预活化状态，而这种状态会受到抗原周围的微环境的影响。对目标参与动力学的梳理也为药物优化提供了指导。了解这方面的结合可以推动更好的原位抗体治疗设计的开发。这也提醒我们，结合亲和力可能与药理学没有直接联系。

1.2.4 CDR的规范结构

早期对免疫球蛋白片段小组结构的抗原结合位点的结构分析显示，6个高变环或CDRs中的5个构象具有有限的主链构象或“规范结构”。规范结构是由环的长度、环的构象、高变环和FRs内的保守氨基酸残基定义的。研究表明，高变环长度是抗原结合位点形貌的主要决定因素，因为它们是决定规范结构的主要因素。

轻链CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3的CDR在长度和氨基酸序列组成上都有优选的规范结构。重链CDR-H1和CDR-H2的CDR也存在这种情况，但重链CDR-H3并非如此，其在长度和氨基酸序列上变化最大。

1.2.5 CDR-H3

CDR-H3是CDR中的一种，具有广泛的长度和氨基酸序列多样性，通常在抗体抗原相互作用中起主要作用。

1.2.6 抗体建模

规范结构的知识使抗体建模(Fv区)的发展成为可能。在治疗性抗体开发项目中，考虑的候选数量远远超过了晶体结构确定过程的能力，抗体建模变得越来越重要。由于这种需要，抗体建模的方法随着蛋白质结构预测领域发展而不断发展。最近，抗体建模评估研究已经开始，以获得洞察抗体结构预测软件结果的质量。

1.3 Fc区域

Fc的三维结构揭示了每个HC的两个恒定域CH2和CH3是如何相互作用的(见图4)。CH3与CH2紧密结合，而CH2与CH3之间没有明显的蛋白质接触。相反，分离CH2s的空间部分被附着在Asn297上的碳水化合物所填充。在某些结构中，两个碳水化合物链通过氢键直接或通过桥接水分子相互作用。CH2s的灵活性有助于它们与C1q和FcγRs相互作用。IgG的Fc区可以与Fcγ受体(Fcγ r)和C1复合体的第一亚组分(C1q)结合，介导抗体依赖的细胞毒性(ADCC)、补体依赖的细胞毒性(CDC)、抗体依赖的细胞吞噬(ADCP)、异位细胞吞噬(trogocytosis)、介质分泌的诱导、并通过与FcRn的相互作用调节组织和血清半衰期。Fc一直是重要工程的焦点，以调节效应功能的活性发现在单核细胞，巨噬细胞，树突状细胞，中性粒细胞，T和B淋巴细胞，和自然杀伤细胞。由于经常有来自不同哺乳动物形式的单克隆抗体的交换，人类Fc与小鼠、食蟹动物和人类Fcγ rs结合的系统比较已经被用来关联体外和体内Fc活性。

1.3.1 Fc CH2 CH3界面

最近，一份IgG2 Fc的两种晶体形式的结构报告对Fc CH2-CH3界面进行了表征。界面主要是两个域之间的非共价相互作用，并辅以有序水分子的存在。将其与同源IgG1 Fcs的结构进行比较，观察到CH2s相对于CH3s的位置发生了变化。进一步分析发现，CH2和CH3之间有一个Fc球窝连接，CH2结构域围绕Leu251侧链旋转，Leu251侧链被埋在由CH3残基Met428、His429、Glu430和His435形成的口袋中。CH2的移动受到CH2、CH3界面和铰链区域的残基的限制。随着结构域相对取向的改变，结构域之间的间隙增大或减小，界面上氨基酸残基的位置也会发生变化。随着结构域的移动，与CH2和CH3界面相关的水结构也在调整。未来的Fc工程可以考虑改变与Fc球窝相关的残留物，可能影响Fc的灵活性，潜在地改变效应器的活性。

1.3.2 Fc CH2糖类

Fc CH2碳水化合物覆盖了结构域的疏水性表面，并有助于填补两个HC CH2之间的空白。每个结构域都与图5中描述的结构共价结合碳水化合物。由于添加了其他糖残基，如唾液酸、n -乙酰氨基葡萄糖和半乳糖，在某些情况下，没有果糖，这种结构可能会发生很大的变化。聚糖的存在有助于蛋白质结构的生物物理稳定性。

1.4 铰链

抗体铰链可分为上铰链、核心铰链和下铰链三个区域，每个区域具有不同的功能作用(见图6)。在N端一侧，上铰链允许Fabs的运动和旋转。根据IgG亚型的不同，中央核心铰链包含不同数量的半胱氨酸残基，形成二硫键，稳定HC的结合。在C端是较低的铰链，允许Fc相对Fabs运动，其氨基酸残基可以参与Fcγ r结合。

人类IgG亚型的铰链在两个重链之间的残基数和可能的二硫键桥数上差异显著。这有助于抗体的整体稳定性。例如，在所有的IgG中，IgG4是唯一 一种经过天然Fab-arm交换产生双特异性抗体分子的亚型。此外，这种多样性，包括氨基酸序列的差异，在一定程度上有助于IgGs与Fc Rs相互作用的强度。

抗体和铰链区稳定性的一个方面是蛋白酶的敏感性。木瓜蛋白酶等蛋白酶用于裂解IgGs的上铰链，产生Fab和Fc片段。下端铰链的剪切导致单裂IgG或带有F(ab)2和Fc片段的双裂IgG。在人类中，这种分裂可能发生在炎症、肿瘤微环境或基质金属蛋白酶(如MMP-3、MMP-12和MMP-7(基质金属蛋白酶))以及其他如组织蛋白酶G、GluV8、胃蛋白酶和IdeS的细菌感染过程中。IgG1、IgG2和IgA铰链区突变可介导对这些酶的某些水平的抗性。这种突变可以防止铰链剪切，以保存治疗性抗体在炎症组织环境中的Fc效应功能。

2. 基于结构的抗体工程

分子工程旨在改善所研究抗体的生化和生物物理特性，使其成为良好的治疗手段和方便的研究工具。在方法上，有两种战略来实现这一目标。合理的方法是基于x射线晶体学、核磁共振(NMR)光谱和计算机建模中获得的结构知识，通常会产生一组变体。与理性的方法相反，经验方法是基于利用噬菌体、核糖体或酵母展示来生成大型文库，并依靠筛选来选择所需的变体。本节综述的重点是构建抗体Fab臂抗原结合功能的合理方法。

2.1 人源化（略）

2.1.1 CDR定义

2.1.2 人类生殖系选择

2.1.3 VH-VL配对

2.1.4 反向突变

2.1.5 去免疫法

2.1.6 表面涂层

2.1.7 超人源化

2.1.8 人源优化

2.2 Lambda到Kappa链转换 （略）

2.3 亲和突变（略）

2.4 特异性（略）

2.5 CMC方面的考虑（略）

2.5.1 可溶性

2.5.2 稳定性

3. 工程抗体活性（略）

3.1 结合域工程

3.2 热调节

3.3 抗体-药物偶联

3.4 Fc活性工程

3.4.1 调节效应器功能突变

3.4.2  改变药代动力学的突变

3.5 双抗

3.5.1 双抗片段

抗原结合片段的融合

单链可变片段的融合

单域抗体的融合

3.5.2 依赖Fc的双抗

重链异质二聚体

轻链控制

3.5.3 选择考虑

4. 发展应用

4.1 多特异性抗体分子

BsAbs的一个自然延伸是有更多的结合臂来创建多特异性抗体，可以有效地在一个目标上参与更多的表位。在图9中，结合域可以包括使用Fab、scFv和VHH结构域或其他支架结合的结合域。随着细胞因子和酶混合的机会，蛋白质工程的可能性并不缺乏。最终，需要通过经验筛选来确定这种多特异性药物的最佳结构。

4.2 胞内定位（略） 

5. 结论

本文综述了该抗体的结构和功能在治疗方面的应用。通过基于实验或模型结构信息的合理设计，讨论了工程抗体可变域的不同实例。Fc区域已被设计用于优化效应功能、聚类和Fc受体的参与。一般来说，Fab和Fc区域的抗体工程是药物开发过程中不可或缺的一部分，随着越来越多的抗体产生用于治疗，抗体工程将继续发展。尽管抗体工程的方法在过去的20年里取得了很大的进展，但新的方法仍有很高的需求。剩下的目标之一是提高计算方法的准确性，这将允许预测点突变，从而提高亲和力和其他感兴趣的属性。新的方法正在不断开发，以创造在效力、特异性、定位和安全性方面优越的基于抗体的分子。结合域的选择可以裁剪成与相关的表位结合。同样，通过工程改变结合臂、Fc区域、双特异性或多特异性结构域的结构，以实现单价或亲和性驱动的参与，将产生更特异、更有效的分子。因此，需要持续的工艺改进以产生足够数量和纯度的目标蛋白，以促进全面的Lead分子选择。抗体结构—功能研究的多样性，仍然有很大的空间来设计适合特定目的的灵丹妙药，以满足不同的治疗需求。