科研 | The ISME Journal：微生物生态位分化解释了海洋氧气最低区域中亚硝酸盐的氧化
编译：Rivc，编辑：木木夕、江舜尧。
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亚硝酸盐是海洋氮循环的重要组成部分。亚硝酸盐的命运决定着固定氮的丢失或保留，而固定氮是所有生物体必不可少的营养素。在反硝化和厌氧氨化过程中，厌氧亚硝酸盐还原成气体会造成损失，亚硝酸盐氧化成硝酸盐则会造成保留。在生物地球化学模型中，亚硝酸盐氧化通常由一个动力学参数和一个氧气阈值表示，低于该阈值时，亚硝酸盐氧化被设置为零。本研究发现亚硝酸盐对亚硝酸盐和氧气浓度的响应在太平洋氧气最小区域中沿着氧化还原梯度变化，表明亚硝酸盐氧化组合的生态位分化。值得注意的是，从缺氧水收集的样品中，通过添加氧气和亚硝酸盐氧化以及氮的损失，在没有氧气消耗的情况下，亚硝酸盐氧化被完全抑制。在同一样品中还检测到亚硝酸盐氧化细菌，包括在缺氧深度具有较高相对丰度的新型进化枝。考虑了在氧化还原梯度上与亚硝酸盐氧化细菌的生态位分化相对应的机制。在生物地球化学模型中实施这些机制对估算的固定氮预算有重要意义。
论文ID
原名：Microbial niche differentiation explains nitriteoxidation in marine oxygen minimum zones
译名：微生物生态位分化解释了海洋氧气最低区域中亚硝酸盐的氧化
期刊：The ISME Journal
IF：9.180
发表时间：2021.01.06
通讯作者：Xin Sun
通讯作者单位：美国普林斯顿大学
试验设计
于2018年3月和4月在ETNP中的两个站（图S1a，近海OMZ站PS2和沿海OMZ站PS3）收集了海水样本。在ODZ的氧/氧界面（顶部）和ODZ的核心进行了NO2-动力学和O2效应实验（≤1天培养）（图S1b和表S1）。在两个站的ODZ核心进行了长时间孵培养（6-7天），以研究在非常低的O2浓度下的氮反应速率。后进行了DNA取样、提取、测序、宏基因组学和元转录组学分析。使用反同位素模型估算NO2-氧化。在ETSP OMZ的两个站的缺氧ODZ岩心中通过歧化作用模拟了NO2-氧化速率的分布（图S6）。
结果
1 底物动力学和O2添加对NO2-氧化的影响
在不同深度检测到NO2-氧化。远洋站（PS2）和沿海站（PS3）的氧气浓度（图S1a）。在大多数来自氧化线和ODZ顶部的样品中，NO2-的氧化速率随NO2-浓度的增加而增加，这与Michaelis-Menten动力学一致（图1）。这些样品的半饱和常数（Km）与先前在低亚硝酸盐OMZ和非OMZ海水中测定的饱和度相似或略高，但远低于在养殖或其他环境中测定的饱和度，证实海洋NOB的原位组装适合低亚硝酸盐条件。二氧化氮− ODZ芯的氧化速率对NO2无响应。氧气添加显着增加了PS2站ODZ顶部的NO2-氧化的Km（图1f），表明NOB与亚硝酸盐的亲和力显着不同，并且在该界面环境中存在不同的氧气偏好。与NO2-不同，O2不会在NO2-的氧化速率上引起简单的Michaelis–Menten样反应。氧气添加刺激NO2-在氧化层深度处采集的样品中的氧化速率（图2a，b），但对任一站的ODZ顶部的NO2-氧化速率均无影响（图2c，d）。值得注意的是，在站PS2的ODZ核心处的NO2-氧化速率（图2e）似乎受到0.6μM O2的刺激，但在较高的O2浓度下降至零。据我们所知，这是通过添加氧气完全抑制NO2-氧化的第一个观察结果，并且仅在从缺氧ODZ核收集的样品中发生。在PS3站的ODZ核心处对添加的O2没有明显的响应（图2f）。在不同深度对NO2-氧化的O2的不同响应意味着不同的O2耐受性是OMZ NOB之间生态位分化的基础。尤其是，在PS2站的ODZ核心处通过添加O2（> 0.6μM）来抑制NO2-氧化，意味着这些特定样品中的主要NOB适应缺氧环境。ODZ顶部（图2c，d）或核心（图2f）缺乏对O2的响应，这意味着具有不同O2偏好的多种NOB并存，并且至少部分原位组合不是常规专性有氧NOB。
图1 PS2和PS3站NO2-氧化速率的亚硝酸盐动力学。
图2 在站PS2和PS3上，NO2-氧化速率对O2的响应。
2 在不消耗氧气的情况下进行NO2-氧化和亚硝酸盐氧化
在两个地点从缺氧的ODZ岩心收集的样品中发生了NO2-氧化，其中测得的O2消耗速率太慢而无法支持所观察到的氧化速率（图3a-d）。在最初的几天中，O2浓度增加（图3a，b，S2a，b），这可能是由于残留在橡胶隔垫中的微量O2的释放所致。有氧NO2-氧化发生在PS2站的第2.5天，以及PS3站的1.5和2天（图3c，d）。当周围的氧气非常低时，NO2-氧化再次发生（图3c，d），并且PS2和PS4站4天后O2浓度稳定。在PS3站6天（图3a，b），氧化速率远高于基于有氧亚硝酸盐氧化化学计量（表S2）的同期O2消耗速率（图3a，b）。在有和没有O2的情况下都会发生NO2-氧化，这表明有氧NOB和厌氧NOB在两个站同时存在，或者是同一微生物在新陈代谢之间切换。可以排除非生物反应。最大NO2-氧化速率（31.7± 在不消耗氧气的情况下，在PS2站检测到6.3 nM d-1），PS3站的最大比率（38.64±12.4 nM d-1）是有氧的。这些结果连同在PS2站抑制O2而不是在PS3站受到抑制的证据（图2e，f）一起，表明在PS2站的缺氧ODZ核心中较大比例的NOB适应了厌氧条件。
探索缺氧ODZ核心中的NOB群落。在两个ETNP站，从两个ODZ核心深度获得了基因组。使用了来自ETSP的两种新型OMZ NOB“物种”（MAG-1和MAG-2）的最完整基因组草图（表S4），以估算它们在两个ETNP的ODZ核心的总微生物群落中的相对丰度。通过将新的序列读数从ETNP映射到两个ETSP MAG来对工作站进行定位。NOB的相对丰度表示为RPKG（每基因组当量每千碱基的读数），在两个站之间有所不同（图4），但MAG-2总是比MAG-1丰富（表S5）。基于在有氧-缺氧界面上的MAG-1相对富集和在缺氧ODZ核心上的MAG-2的相对富集，提出将MAG-1用作微需氧菌，而MAG-2可能是厌氧专家。对O2具有高亲和力的末端氧化酶由MAG-1编码，但在MAG-2中缺失。尽管在MAG-2中未确认厌氧代谢，但MAG-1和MAG-2可能具有不同的O2敏感性。MAG-2的相对丰度是9.8倍在PS2站比MAG-1高，但在PS3站仅高1.9倍（表S5），这与相对明显厌氧NO2的优势（图3c）和NO2的抑制 −在PS2站被O2氧化（图2e）。通过将本研究中获得的ETNP宏基因组读数映射到先前鉴定的OMZ nxrB（亚硝酸盐氧化还原酶）基因序列，我们还估算了厌氧氨氧化酶和其他（假定的）NOB的相对丰度（RPKG）（图4）。两个站上两个最丰富的nxrB基因属于推定的nxrB簇，它们不能与任何已知的NOB或厌氧氨氧化酶连锁。这些未知基因的大量存在，代表着潜在的未知代谢，表明在ODZ中亚硝酸盐的代谢中，其他未被发现的微生物甚至比已知物种和MAG更重要。
图3 在ODZ中心PS2和PS3确定的亚硝酸盐氧化和氮损失过程。所有速率均为nM / d或nM-N / d。
图4 在ETNP站PS2和PS3的ODZ核心中确定的OMZ nxrB基因的相对丰度（RPKG）。
3 沿氧化还原梯度对应于NOB生态位分化的潜在机制
可以通过不同的机制解释不同氧化还原层（即ODZ的顶部和ODZ的核心）中的NO2-氧化（图S3）。NOB释放氧气以氧化氧化层中的亚硝酸盐。在ODZ的顶部，通常是无法检测到O2的界面，瞬态入侵可能支持NO2-氧化。当无法检测到O2时，即使本研究中的所有培养均在黑暗中进行，隐含的氧气循环（即深部叶绿素最大值中原位O2的产生，都归因于丰富的原绿球菌）可以支持原位速率。发现在ODZ顶部的一些NOB对O2的亲和力非常高，在相同环境中高于它们的硝化伙伴氨氧化剂。因此，这些NOB可以使用该有氧-缺氧界面上可用的痕量O2。或者，建议使用碘酸盐作为NO2-的可能氧化剂，并且在ODZ顶部有可能从有氧层流出碘酸盐。
在ODZ核心中，必须考虑以下几种机制：（a）ODZ核心中既没有O2也没有碘酸盐（图S3）。在测量这些速率的同一月或同一年进行的碘酸盐和碘化物浓度测量结果表明，ETNP ODZ芯中碘酸盐通常被消耗掉了。ODZ内部次生亚硝酸盐最大值附近的碘酸盐浓度几乎恒定；因此，碘酸盐流量不足以支持观察到的NO2- 氧化速率。另外，当在亚硝酸盐存在下加入碘酸盐时，在氧化线中检测到碘酸盐还原，但通常低于缺氧ODZs的检测限，这表明这些样品中的微生物不能使用碘酸盐氧化亚硝酸盐。（b）曾有过短暂入侵O2的报道，但在核心地区却很少见。厌氧NO2-在上述温育实验中观察到的氧化表明该反应可能在没有O2的情况下发生。（c）ODZ样品中的叶绿素浓度非常低（图S1b），并且ODZ核心较暗，因此光合作用不能支持原位或小瓶中亚硝酸盐氧化的O2通量。（d）仅在非常低的pH值（<6）下，热力学上有利于Mn4+或Fe3+氧化NO2-的作用。即使在较高的pH值下这些金属可以进行酶促氧化，但在OMZ中总溶解的Mn（0–5 nM）和Fe（0–1 nM）浓度仍然太低，无法支持所观察到的亚硝酸盐氧化速率。（e）厌氧细菌厌氧地将NO2-氧化为NO3-，同时使用NH4+将NO2-还原为N2。根据已知的化学计量表（表S2），在我们检测到NO2的同一瓶中测量的厌氧菌率 − PS2站的氧化速率（图3g）分别占第5天和5.5天测得的厌氧NO2-氧化速率的7％和2％（图3c）。在PS3站，未检测到厌氧氨氧化。因此，单独的厌氧氨氧化不能解释厌氧NO2-氧化。（f）已提出可逆亚硝酸盐氧化还原酶催化NO2之间的双向交换，与净浓度变化无关。这个“徒劳的”循环可能导致NO3-和NO2-同位素分馏，而不会产生能量来支持细胞生长。因此，仅此过程可能可以解释同位素从标记的15NO2-富集到NO3-中（图S2c，d），但不能解释对NO2的抑制作用。两个站均存在NOB（图4），ETNP和ETSP OMZ的ODZ处的转录活性NOB（图S4）或亚硝酸盐氧化还原酶数量增加OMZ中O2减少的酶。这表明，至少在某些时候，通过某些能量生成机制在两个站点上发生了原位NO2-氧化，以支持 NOB增长（图S3）。（g）NO2-歧化。该反应在热力学上是有利的，尽管实际上尚未发现。如果被证实歧化，则除厌氧氨氧化和反硝化外，还构成氮损失的第三条途径。因为在NO2-歧化和反硝化过程中，N2中的两个N原子必须来自NO2-，所以示踪剂孵育中从两个途径产生的N2的同位素特征都相同。因此，以前使用稳定同位素示踪剂实验测得的“反硝化作用”实际上可能是规范反硝化作用加上NO2-歧化作用的组合。根据化学计量（等式（1）），根据此处测得的N2生成量和NO2-的氧化率，由NO2-歧化产生的N2可能占NO2-生成的N2的生成率的20-100％（图3e， F）。
OMZ NOB可能具有通过耦合NO2-氧化和NO2-还原进行NO2-歧化的潜力（表S6）。ODZ MAGs缺少此过程所需的唯一基因是NO歧化酶基因（nod）。在两个ETSP NOB MAGs或两个ETNP MAGs中，均未发现与氧化假丝酵母的Nod相关的序列。与Ca不同的不明地点头。可能存在羟甲甲烷菌，但由于缺乏nod参考文献而无法鉴定。另外，尽管海洋中的氯酸盐和亚氯酸盐的浓度已逐渐减少，但通过NXR将氯酸盐还原为亚氯酸盐后，亚氯酸盐的歧化可以提供内部氧气。发现亚硝酸盐歧化酶（Cld）在硝化细菌NOB和硝化螺菌NOB中起作用，并提出在缺氧条件下为NOB提供氧气。尽管ETNP MAG的MAG质量低，但来自ETSP OMZ的NOB MAG中仍存在编码Cld的DNA序列和ETNP PS2 MAG-11和ETNP PS3 MAG-54。然而，被提议作为Cld活性标记的精氨酸173 ，在MAG-1和MAG-2中被亮氨酸取代（图S5a）。尽管在ETNP MAGs编码的短Cld序列中没有包括相同的Cld位置，但它们与MAG-2的Cld高度相似（图S5b）表明在ETNP NOB的Cld中发现精氨酸173的机会。MAG低。因此，需要通过实验进一步证实Cld在所有类似硝基孢菌的OMZ NOB中的主要功能。来自其他属的NOB具有令人惊讶的通用代谢能力。OMZ NOB也可以使用其他尚未发现代谢能在缺氧水中生存。
图5 逆一维模型和氮循环速率模型示意图。
4 生物地球化学模型对海洋氮预算的意义
将NO2-歧化反应添加到已建立的逆模型中，以定量测试这种新提出的途径对氮预算的重要性（图5a，b）。该模型模拟了ETSP OMZ ODZs中的氮循环速率，其中可测得氮化合物的浓度和自然丰度同位素数据（表S7）。修改后的模型中模拟的所有速率（图5c–j），特别是通过NO2-歧化引起的NO2-还原和NO2-氧化，都具有更好的匹配度（即，相同的幅度）的测量速率（在模型输入数据收集的同时和位置，当缺氧ODZ中包含NO2-歧化时，模拟的总氮损失相近或更低（最高62％）（图5f，j），因为ODZ中的轻NO2-和重NO3-可以归因于除了传统的氮损失工艺的分馏之外，还可以进行NO2-氧化的同位素反分馏。尽管缺氧水中NO2-氧化的机理仍有待实验验证，但此处的建模结果表明，在不同的氧化还原条件下模拟反应时，必须考虑微生物的生态位分化。NO2-氧化是氮循环中的关键枢纽，它限制了氮的保留比例并影响了氮损失的总体估算。大多数当前模型使用固定的O2正阈值来确定OMZ中何时以及何处发生NO2-氧化，并使用一个参数化来表征其动力学。然而，我们的结果表明，在整个OMZ的氧化还原梯度中都发生了NO2-氧化，并且底物动力学，O2响应和NO2-氧化的潜在机理在深度之间也有所不同，这可能是由于不同的NOB占据了不同的生态位。由于全球气候变化，预计海洋的低氧区域将在未来130年内扩展。沿海上升流区等动态区域会受到季节性养分和氧气波动的影响。因此，此处确定的NO2-氧化对NO2-和O2的响应应该应用于其他系统，并且可以改善对不断变化的海洋中长期和短期氮预算的预测。发现在无O2的情况下发生亚硝酸盐氧化，但在ODZ中被O2添加抑制的亚硝酸盐氧化要求进行后续研究，尤其是从缺氧环境中分离出新型NOB。
评论
本研究发现了亚硝酸盐对亚硝酸盐和氧气浓度的响应在太平洋氧气最小区域中沿着氧化还原梯度变化。考虑了在氧化还原梯度上与亚硝酸盐氧化细菌的生态位分化相对应的机制。在生物地球化学模型中实施这些机制对估算的固定氮预算有重要意义。
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