科研 | 吉林大学：黄芪甲苷对顺铂诱导的大鼠急性肾损伤的保护相关代谢特征和生物标记物的改变（国人佳作）
编译：Y.too，编辑：Tracy、江舜尧。
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顺铂(cis-diaminedichloroplatinum,CDDP)诱导的急性肾损伤(acute kidney injury, AKI)限制了CDDP的治疗，科学界目前迫切需要解决这个问题。我们前期的研究表明，中药黄芪的活性成分黄芪甲苷(astragaloside IV,AS IV)对CDDP诱导的AKI有一定的缓解作用。为了探索其机制，我们进行了代谢组学研究，以探索改变的代谢通路并筛选敏感的生物标志物。我们将24只大鼠随机分为3组，分别给予灌胃液治疗组(对照组)、腹腔注射CDDP组和腹腔注射CDDP 加口服AS IV治疗，用高效液相色谱飞行时间质谱分析血清、尿液和肾脏样本的代谢谱。尿液样本中有38种关键代谢物，血清样本中有20种关键代谢物，肾脏样本中有16种关键代谢物，这些代谢物是由于AS IV对CDDP诱导的AKI的保护而发生了显著改变，而这一变化相对于仅用CDDP处理而言。CDDP+AS IV协同作用显著改变了血液中的两条通路(不饱和脂肪酸生物合成和丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸代谢)，尿中的五条通路(苯丙氨酸代谢；苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成；精氨酸生物合成；精氨酸和脯氨酸代谢；组氨酸代谢)，以及肾脏中的五种途径(谷胱甘肽代谢；丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢；乙醛酸和二羧酸代谢；精氨酸和脯氨酸代谢以及D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代谢)。代谢途径主要与炎症反应、氧化应激和能量代谢的改善有关，血清中的肾上腺酸和尿中的L-组氨酸和L-蛋氨酸被鉴定为敏感的生物标志物。本研究为理解AS IV对CDDP诱导的AKI的保护机制提供了新的见解，并确定了三个候选的生物标志物来评估预防治疗和治疗效果。
论文ID
实验设计
实验结果
1. 评估AKI
AS IV对CDDP诱导的大鼠AKI有保护作用，与CDDP组相比，其血清肌酐(creatinine, Cr)和血尿素氮(blood urea nitrogen, BUN)水平、体重、食物摄食和组织病理学变化减少。更具体的是，生化分析显示，与对照组和CDDP+AS IV组相比，CDDP组血清Cr和BUN水平均显著升高(图1a和1b)。3组在第5天前体重相近，第8天对照组和CDDP+AS IV组体重相近，但第8天CDDP组体重明显低于CDDP+AS IV组(图1c)。与对照组相比，CDDP组的食物消耗量(在CDDP/盐水注射后2天内)显著减少，而CDDP+AS IV联合治疗改善了这种减少(图1d)。H＆E染色显示CDDP诱导的损伤主要集中在肾小管(但不影响肾小球形态)，并伴有炎性细胞浸润和上皮细胞损伤，肾小管腔增加，蛋白管型和液泡出现，CDDP + AS IV协同治疗可改善这些变化(图1e)。上述结果表明，AS IV对CDDP诱导的AKI有保护作用，可维持大鼠肾功能。
图1 大鼠急性肾损伤(AKI)的评估
(a)血清肌酐水平。(b)血尿素氮的水平。(c)身体重量。(d)食物消费量。(e)肾脏形态(CDDP组和CDDP+AS IV改善组显示蛋白管型、上皮细胞损伤、小管腔的形态)。
2. 分析方法的验证
我们对随机选取的6个化合物进行保留时间(retention time, RT)、分子量(molecular weight,m/z)和峰强度(peak intensity, PI)在质控样品(quality control, QC)中的重复性评价，以验证分析方法的性能。表1中的结果表明，基于符合预先定义的接受标准的相对标准偏差(relative standarddeviations, RSD)值，稳定性和重复性是足够的。此外，我们采用主成分分析(principalcomponent analysis, PCA)生成的QC样本得分图分布紧密，这些结果表明，该方法在整个研究中按照预期执行。
表1 HPLC-TOF/MS对m/z、RT和PI参数分析方法的验证
3. 代谢谱的多变量分析
首先，我们用CDDP和AS IV共处理后，覆盖血清、尿液和肾脏样本的代表性正、负总离子色谱(TICs)(图2)，很容易观察到差异。PCA评分图(图3)显示，无论是正离子模式还是负离子模式，三组之间都存在明显的分离，这表明我们成功地建立了CDDP诱导的肾毒性模型，并可以利用代谢谱来筛选生物标志物。
图2 共处理CDDP和AS IV后，血清、尿液和肾脏样本的代表性正、负总离子色谱(TICs)
图3 正和负离子模式下血清、尿液和肾脏样本的PCA评分图
4. 鉴定显著改变的代谢物
PLS-DA评分图显示，CDDP和CDDP+AS IV组明显分离(图4)。内源性代谢物是根据准确的分子量和MS/MS片段离子鉴定出的显著改变的候选代谢物(VIP>1和p<0.05)。我们在尿液样本中鉴定了38种关键代谢物，在血清样本中我们鉴定了20种关键代谢物，在肾脏样本中鉴定了16种具有显著改变的关键代谢物（见表2）。我们还使用热图来观察代谢产物的变化(图5)，热图显示了血清、尿液和肾脏样本中代谢产物的上调和下调。
图4 CDDP和CDDP+AS IV组血清、尿液、肾脏样品在正和负离子模式下的PLS-DA评分图
表2 在大鼠血清、尿液和肾脏样本中鉴定的代谢物信息
图5 血清、尿液和肾脏样品中显著改变代谢物的热图
红色表示上调的代谢产物，蓝色表示下调的代谢产物。
5. 代谢途径分析
我们分别使用血清、尿液和肾脏样品中显著改变的代谢物在MetaboAnalyst 3.0进行代谢通路分析，使用KEGG数据库识别改变的通路。结果表明，CDDP+AS IV协同处理可能通过显著改变血液中的两条通路(不饱和脂肪酸[UFAs]生物合成及丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢)和尿液中的五条通路(苯丙氨酸代谢；苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成；精氨酸生物合成；精氨酸和脯氨酸代谢；和组氨酸代谢)，以及肾脏中的五种通路(谷胱甘肽代谢；丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢；乙醛酸和二羧酸代谢；精氨酸和脯氨酸代谢)(图6)。代谢通路网络如图7所示，显示了网络中代谢产物的上调和下调。
图6 通路影响值与血清、尿液和肾脏样本相关
每个圆的大小和颜色分别反映了路径影响值和p值。
图7 基于AS IV处理CDDP诱导的大鼠AKI后显著改变的代谢物的代谢途径改变
红色表示上调的代谢产物，蓝色表示下调的代谢产物。
6. 筛选潜在的生物标志物
在对相互间显著改变的代谢物的分析中，我们鉴定出了尿液样本中的5个潜在生物标志物和血清样本中的2个。根据AUC>0.85进行ROC曲线分析，我们进一步确定了最敏感的生物标志物，因此，血清中的肾上腺酸和尿液中的L-甲硫氨酸和L -组氨酸被确定为AS IV治疗效果的潜在生物标志物，每个样本的离子峰的相对强度反映了实际浓度(图8)。
图8 特征曲线(ROC)分析值和生物标志物的相对水平
讨论
尽管CDDP显示出良好的抗肿瘤活性，但CDDP诱导的AKI的风险限制了CDDP作为化疗的使用。因此，为了提高CDDP的效用，预防AKI已经成为一个紧迫的课题，并为解决这个问题科学家们做出了许多努力。中药在中国和东亚其他地区已经使用了数千年，其在预防和治疗化疗相关不良反应方面的应用也得到了广泛的探索，包括CDDP诱导的AKI。
AS IV是黄芪的主要活性化合物之一，具有良好的抗某些疾病活性，包括对多种肾功能障碍的保护作用。其中一个重点是AS IV对CDDP诱导的AKI的保护作用，这是CDDP的主要毒性作用；然而，在代谢通路的相关变化以及生物标志物的鉴定方面研究较少。在本研究中，我们对大鼠血清、尿液和肾脏样本进行代谢组学分析，以探索AS IV介导的对CDDP诱导的AKI的保护机制，并筛选关键的AKI生物标志物。我们鉴定了血清、尿液和肾脏样本中显著改变的内源性代谢物，我们还鉴定了相关的代谢途径，如下所述。
1. 氨基酸代谢
5种氨基酸代谢途径受到AS IV的影响，这些可能是预防CDDP诱导的AKI的关键。它们包括丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢；苯丙氨酸代谢;苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成；精氨酸生物合成;精氨酸和脯氨酸代谢；组氨酸代谢。氨基酸是蛋白质的主要组成部分，对其他组织功能也很重要。下文讨论了氨基酸的改变以及这些改变在AS IV介导的针对CDDP诱导的AKI的保护中的潜在作用。
谷氨酰胺是人体内含量最丰富的氨基酸，具有免疫调节等多种功能，包括调节巨噬细胞的炎症反应。炎症是CDDP诱导AKI的关键因素，NF-κB、TNF-α和IL-18上调；CDDP+AS IV联合治疗可上调谷氨酰胺代谢并减少这些炎症细胞因子的产生。D -谷氨酰胺和D -谷氨酸代谢也发挥抗氧化作用，防御肾脏自由基损伤和氧化应激；此外，谷氨酰胺和丙氨酸是糖原性氨基酸，当碳水化合物不足时，它们可以转化为葡萄糖来提供能量。
必需氨基酸精氨酸是尿素循环中的关键化合物，是尿素、肌酸和一氧化氮的前体，主要参与代谢和免疫调节。在对炎症细胞因子的反应中，精氨酸代谢被上调以合成尿素，肌酸和脯氨酸；精氨酸和脯氨酸的代谢和合成紊乱会显著影响下游代谢物的产生，例如，肾、肝损伤显著改变肌酸和肌酐，而肌酸和肌酐水平反映损伤程度。
在CDDP+AS IV的协同作用下，苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成以及苯丙氨酸的代谢均发生了改变(前者上调，后者下调)。L-苯丙氨酸是人体内一种必需氨基酸，可被苯丙氨酸羟化酶转化为L-酪氨酸，L -酪氨酸与能量代谢和免疫有关，色氨酸与多种保护功能相关，包括调节氧化应激、免疫反应和炎症。
组氨酸代谢通路CDDP+AS IV协同作用的最后一条通路。组氨酸是哺乳动物的一种必需氨基酸，可与β-丙氨酸结合形成鹅肌肽和肌肽，与清除活性氧(ROS)和保护氧化应激有关。组氨酸可以脱羧成组胺，从而调节炎症和自身免疫。
2.乙醛酸和二羧酸代谢
乙醛酸和二羧酸代谢途径有助于能量代谢过程中的三羧酸循环。顺乌头酸是不饱和三羧酸的一种，是柠檬酸的中间体，是三羧酸循环的主要内源性物质，是人体能量的重要来源。与对照组相比，CDDP诱导的肾损伤后顺式乌头酸水平降低，而与CDDP+AS IV联合治疗组相比，顺式乌头酸水平升高，这表明，AS IV可能改善能量代谢，以保护CDDP诱导的AKI。
3.谷胱甘肽代谢
CDDP诱导ROS的形成，而ROS可被肾线粒体中的谷胱甘肽降低，这一过程对减弱AKI至关重要。CDDP使GSH水平降低，抗氧化能力减弱，线粒体氧化应激增加，从而加重肾脏毒性。CDDP+AS IV联合治疗可减少谷胱甘肽代谢通路的中断，焦谷氨酸是一种普遍存在的谷氨酸衍生物谷胱甘肽循环代谢产物，AS IV处理后肾脏中焦谷氨酸和谷氨酸含量增加，暗示GSH循环的激活有利于CDDP诱导的急性肾损伤的抗氧化应激。
UFAs与调节免疫功能有关，包括淋巴细胞增殖。它们也与各种疾病的氧化应激有关，在氧化应激下，多种UFAs(如亚油酸、亚麻酸、花生四烯酸、二十二碳六烯酸)可被氧化产生并释放到血液中，例如，在血液样本中检测到对人体健康必不可少的亚麻酸和亚油酸的氧化产物，尽管它们的浓度很低，氧化产物也需被评估；UFAs也能保持膜的流动性，但含量的增加会降低磷脂的打包能力。因此，与单纯CDDP治疗相比，CDDP+AS IV联合治疗后血清样品中几种UFAs水平较低，可能表明氧化应激降低，细胞膜稳定性增强。
结论
综上所述，AS IV可能通过改善氨基酸代谢、乙醛酸和二羧酸代谢、谷胱甘肽代谢、UFA生物合成等多种代谢途径来保护CDDP诱导的AKI。这些通路主要与调节炎症反应、减少氧化应激和改善能量代谢有关，这可能是AS IV对CDDP诱导的AKI的保护机制。
AKI的早期治疗和评估AKI阶段很重要，因为AKI可导致慢性肾脏疾病，甚至增加死亡的风险。许多研究表明，新的生物标志物可能有助于鉴别肾小管损伤患者，而不管其是否表现为明显的临床综合征。血清，尤其是尿液，是很容易获得的样本，因此使用这些样本来识别AKI的生物标志物将是有益的。为了鉴定最敏感的生物标志物，我们鉴定了血清和尿液样本中各组间显著改变的代谢物。我们还鉴定了三个敏感的生物标志物，包括血清中的肾上腺酸和尿中的L -组氨酸和L -蛋氨酸，这是基于PCA中确定的三个独立的组。在两两比较中，各组之间的变化是显著的，CDDP+AS IV组的生物标志物水平在三组中处于中间位置，低于CDDP组，但高于对照组，因此，它们可以反映机体的敏感变化，可能对评估治疗效果和早期检测AKI有帮助。
本研究存在几个局限性:首先，我们只探索了AKI模型中的代谢组学，对CDDP诱导的慢性肾损伤的影响需要长期研究；其次，需要进一步研究多种剂量和治疗时间，以阐明AS IV对CDDP诱导的AKI的渐进影响；第三，将新的生物标志物与早期的生物标志物如肾损伤分子-1(KIM-1)进行比较，我们将进一步进行评估。
综上所述，我们通过代谢组学研究，探讨AS IV对CDDP诱导的大鼠AKI的保护机制和生物标志物。AS IV可通过减少炎症反应、减少氧化应激和改善能量代谢来保护CDDP诱导的AKI；血清中的肾上腺酸和尿中的L-组氨酸和L-蛋氨酸是敏感的生物标志物，可用于评估预防治疗和治疗效果。