沙门氏菌检测实验原理及操作步骤

一、沙门氏菌简介：

通过人或动物的消化道传播，在各类食物中毒案例中排前两位，主要并发症为肠胃炎、败血症。

常见的被污染食品为：

肉制品：美国约20%，日本约10.3%，英国约9.9%；

蛋制品：3.9%~43.7%，取决于蛋壳污染程度；

蔬菜：欧美生食较多。

污染的原因：

生前带菌交叉污染；

带菌者污染；

患病者污染；

水源污染。

二、沙门氏菌生物学特性：

肠杆菌科，沙门氏菌属，6个亚属I~VI，亚属III称为亚利桑那菌。

沙门氏菌为革兰氏阴性菌，短杆菌，无芽孢，无荚膜，周生鞭毛，有动力（也有无动力的变种），需氧兼性厌氧，35℃~37℃为最适生长温度，pH6.8~7.8为最适，能在营养琼脂上生长，菌落直径2~3mm，圆形或卵形，无色半透明，液体培养基中混合均匀生长。

不发酵乳糖、蔗糖，不液化明胶，不能分解蛋白质，也不产生靛基质，不分解尿素，有规律的发酵葡萄糖并产生气体。

与埃希氏菌属的主要区别在硫化氢反应和乳糖反应。

对热及外界环境抵抗力中等，60℃ 20~30min即被杀死，普通水中不易繁殖但可存活2~3周，自然环境粪便中生存1~2月，干燥垫草中生存8~20周，冰箱中生存3~4月，-5℃存活10月；

对化学药品抵抗力较弱，对氯霉素敏感，5%苯酚5min即可杀死，胆盐、煌绿及孔雀绿抑制作用大但对肠杆菌抑制作用弱，可用以制备选择性培养基。

三、沙门氏菌抗原构造和分类：

菌体抗原，记为O抗原，多糖-类脂-蛋白质复合物，加热至100℃2.5h不能被破坏，也不能被乙醇和0.1%石碳酸破坏，多糖决定O抗原特异性，用于分群。

鞭毛抗原，记为H抗原，蛋白质，不耐热，60℃15min或乙醇处理后被破坏，沙门H抗原有两种，第一相特异相，第二相非特异相，用于分型。

表面抗原，要求掌握Vi抗原，糖脂，60℃30min或100℃5min即可破坏，可阻止O抗原与O抗体的特异性凝集反应，但Vi抗原被破坏后O抗体仍可和相应的O抗原凝集。

四、变异性

4.1 S-R初次分离菌株一般是光滑型，经长期人工传代培养，菌体特意多糖抗原丧失，在盐水中自凝。

4.2 H-O有鞭毛的细菌失去鞭毛的变异。

4.3 位相变异 双相H抗原的沙门氏菌变成只有其中某一相H抗原的单相菌。

沙门氏菌血清学分型时，如遇到单相菌，特别是只有第二相时，需反复分离和诱导出第一相方可鉴定。

4.4 V-W 失去Vi抗原

五、检验原理

食品中沙门氏菌含量较少，且常由于食品加工过程使其受到损伤而处于濒死状态，所以对某些加工食品（一般生鲜蛋或肉类）必须经过前增菌处理，即无选择性的培养基使其恢复活力，再进行选择性增菌，使沙门增殖，其他大多数细菌收到抑制。

利用沙门的生化特征，借助于三糖铁、靛基质、尿素、KCN、赖氨酸等试验可与肠道其他菌属相鉴别。

通过菌种特殊的抗原结构（O抗原为主），可以把他们分辨出来。

复活（前增菌）→培养（选择性增菌）→分离（平板划线分离培养）→鉴定（生化鉴定/血清鉴定）

六、操作步骤

6.1 前增菌

25g（ml）检样放入225ml缓冲蛋白胨水BPW（Buffered Peptone Water）均质（建议拍打式均质器），36℃±1℃培养8~18h。

酸性或碱性样品需用1mol/ml无菌氢氧化钠或盐酸调节pH至6.8±0.2，用试纸测量。

6.2 增菌

摇动增菌培养物，移1ml转种于10ml四硫磺酸钠煌绿TTB增菌液中，42℃±1℃培养18~24h。适合除伤寒副伤寒沙门氏菌培养。浅黄色。

同时，移1ml转种于10ml亚硒酸盐胱氨酸SC增菌液中，36℃±1℃培养18~24h。适合伤寒副伤寒沙门氏菌培养。

亚硒酸氢钠对革兰氏阴性菌G-有毒，磷酸盐中和毒性，促沙抑大，亚硒酸盐还原时，pH上升，乳糖分解产酸，磷酸盐缓冲，维持培养基中性。煮沸，流动蒸汽灭菌，不能高压灭菌。

6.3 分离

6.3.1 亚硫酸铋（BS）琼脂平板：强选择性，强烈抑制大肠类，略抑制沙门，需延长培养时间，无乳糖指示系统，有硫化氢指示系统。还原亚硫酸铋为硫化铋，产物为黑色或褐色，亚属III有金属光泽。灭菌方式为煮沸3次。本身为绿色。

用接种环取增菌液1环，划线接种，36℃±1℃培养40~48h。

典型菌落为黑色或褐色，亚利桑那菌为黑色有金属光泽。

6.3.2 三种平板任选其一，用接种环取增菌液1环，划线接种，36℃±1℃培养18~24h。

木糖赖氨酸脱氧胆盐XLD：产生硫化氢，黑色中心周边无色。

HE琼脂：分解乳糖为黄色，不分解乳糖为蓝绿色或蓝色。

科玛嘉沙门氏菌显色平板：沙门氏为紫红色，埃希氏菌为蓝色。

6.4 生化试验及初步血清学鉴定

6.4.1 初步鉴定

平板上挑取2~5个典型或可疑菌落，分别接种三糖铁TSI（表面划s，内部穿刺）和赖氨酸脱羧酶，36℃±1℃培养18~24h，必要时延长到48小时。

三糖铁阴性为绛红色，阳性为黄色。

大肠发酵乳糖，令三糖铁斜面和底层变为黄色。

大肠具有某种氨基酸的脱羧酶，可使氨基酸脱去羧基产生氨和二氧化碳，氨使pH>7，此时指示剂溴麝香草酚蓝显蓝色（偏紫色），酸性为黄色。

因此可排除三糖铁琼脂内斜面产酸（阳性）、底层产酸（阳性）、赖氨酸脱羧酶试验阴性的菌株。

其他反应结果均有沙门氏菌属的可能，也均有不是的可能。

6.4.2生化试验

初步鉴定的同一批菌落，接种尿素琼脂pH7.2和胰蛋白胨水（靛基质）、氰化钾培养基，36℃±1℃培养18~24h，必要时延长到48小时。

靛基质试验（吲哚）：

埃希氏菌能分解蛋白胨中的色氨酸，产生的靛基质与对二甲氨基苯甲醛结合，形成红色化合物。

将被检细菌接种到胰蛋白胨水培养基中，培养后滴加数滴试剂于培养基液面，轻轻摇动，观察结果。

出现红色为阳性，出现黄色为阴性。阳性对照是埃希氏菌，阴性对照是产气肠杆菌。

尿素酶试验：

某些细菌具有尿素酶，如变形杆菌，在含有尿素的培养基中，能分解尿素，产生氨，使培养基呈碱性，此时培养基中酚红指示剂显红色。

把被检细菌接种到尿素固体斜面培养基上，培养4h检查一次，再每天检查一次，培养5天，观察结果。

出现红色为阳性，阳性对照菌是变形杆菌，阴性对照菌是大肠埃希氏菌。

反应序号A1：硫化氢阳性，靛基质阴性，尿素琼脂阴性，氰化钾阴性，赖氨酸脱羧酶阳性为典型反应，判定为沙门氏菌属。尿素、氰化钾、赖氨酸脱羧基三项中有两项异常，为非沙门氏菌。

反应序号A2：硫化氢阳性，靛基质阳性，尿素琼脂阴性，氰化钾阴性，赖氨酸脱羧酶阳性，需补做甘露醇和山梨醇试验。沙门氏菌靛基质阳性变体两项都是阳性，但需要结合血清学鉴定结果进行判定。

反应序号A3：硫化氢阴性，靛基质阴性，尿素琼脂阴性，氰化钾阴性，赖氨酸脱羧酶多数阳性，少数阴性，补做ONPG，阴性为沙门氏菌，赖氨酸脱羧酶基本阳性，只有甲型副伤寒沙门阴性。

ONPG即O-nitrophenyl-β-D-galactopyranside邻硝基酚-β-D-半乳糖苷。发酵乳糖的细菌有两类酶，渗透酶和β-半乳糖苷酶，渗透酶将乳糖分子带入菌细胞内，β-半乳糖苷酶可将乳糖的β-半乳糖苷链切断，产生葡萄糖和半乳糖。迟缓发酵乳糖的细菌缺乏渗透酶，ONPG渗入细胞内，被β-半乳糖苷酶分解产生邻位硝基苯酚，显黄色。将被检细菌接种到1%的乳糖肉汤琼脂培养基上，37℃培养过夜，取菌苔接种于0.25ml生理盐水中做成悬液，加入1滴甲苯，并充分震摇，使酶释放。在悬液中再加入ONPG液0.25ml，混匀，置于37℃培养箱或水浴箱中，分别在20min和3h后观察培养液反映结果。呈黄色为阳性，一般在20~30min即显黄色，不出现黄色为阴性。阳性对照菌为枸缘酸盐杆菌、亚利桑那菌，阴性对照菌是沙门氏菌。

6.4.3 自动鉴定方法

根据初步鉴定结果，从营养琼脂平板上挑取可疑菌落，用生理盐水制备成浓度适当的菌悬液，使用API20E生化鉴定试剂盒或VITEK全自动微生物鉴定系统进行鉴定。

6.5 A-F多价诊断血清凝集试验

当图片染色和生化反应都疑为沙门氏时，应用沙门氏属A-F群多价O诊断血清进行凝集试验，同时用生理盐水作对照。

6.5.1 抗原准备

1.2%~1.5%琼脂培养物作为玻片凝集试验的抗原。

O血清不凝集时，将菌株接种在2%~3%琼脂培养基上再检查，挑取菌苔于1ml生理盐水中做成浓菌液，酒精灯火焰上煮沸后在检查。检查是否Vi抗原作用。

H抗原发育不良时，将菌株接种在0.55%~0.65%半固体琼脂平板中央，菌落蔓延生长时，在其边缘部分取菌检查，或将菌株通过装有0.3%~0.4%半固体琼脂的小玻管1~2次，自远端取菌培养后在检查。

6.5.2 多价菌体抗原O鉴定

在玻片上划出两个约1cm×2cm区域，挑取1环待测菌，各放1/2环于玻片上的每一个区域上部，在其中一个区域下部加入一滴生理盐水，作为对照。再用无菌接种环或针分别将两个区域菌落研成乳状液。将玻片倾斜，摇动混合1分钟，并对着黑暗背景观察，任何程度的凝集现象皆为阳性反应。

6.5.3 多价鞭毛抗原H鉴定

与菌体抗原类同。

七、检查结果

综合生化试验和A-F多价诊断血清凝集结果，报告：25g（ml）样品检出或未检出沙门氏菌，必要时将菌株送至专业检验检疫部门进一步血清学鉴定。