科研 | BMC plant biology：转录组和代谢组学分析揭示了CoA在驼蹄瓣属植物耐盐性中的作用（国人作品）
编译：有点卡，编辑：十九、江舜尧。
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驼蹄瓣属植物主要生长在荒漠和半荒漠地区，具有良好的抗旱、抗盐、抗碱、抗重金属、抗平瘠土壤、抗风蚀、抗流沙能力，能长期适应盐渍化土壤。为了探究驼蹄瓣属植物苗期独特的耐盐机制，本研究以三种驼蹄瓣属植物（细茎驼蹄瓣、长梗驼蹄瓣和驼蹄瓣）为材料，通过转录组和代谢组学分析，筛选出与耐盐性相关的基因和代谢途径，推测驼蹄瓣属植物应对盐胁迫的可能机制，为提高植物的耐盐性提供新思路，同时也为进一步研究支链氨基酸转氨酶（BCAT）基因调控驼蹄瓣属植物耐盐性的分子机制提供理论基础。
论文ID
原名：Transcriptomic and metabolomic analysisreveals the role of CoA in the salt tolerance of Zygophyllum spp.
译名：转录组和代谢组学分析揭示了CoA在驼蹄瓣属植物耐盐性中的作用
期刊：BMC plant biology
IF：3.67
发表时间：2020.01
通讯作者：焦培培
通讯作者单位：塔里木大学生命科学学院&塔里木盆地生物资源保护利用重点实验室
DOI号：https://doi.org/10.1186/s12870-019-2226-8
实验设计
结果
1 三种驼蹄瓣属植物的解剖学差异
植物适应盐渍土后，其形态也会随之改变。研究者分析了自然环境中生长的细茎驼蹄瓣、长梗驼蹄瓣和驼蹄瓣主要茎叶的解剖结构。结果表明，细茎驼蹄瓣主茎中髓的面积最大，驼蹄瓣的最小（图1a-c）。驼蹄瓣的叶子最薄而其余两种无显著性差异（图1d-f）。统计学分析表明，细茎驼蹄瓣的木质部、韧皮部和皮层均比驼蹄瓣的厚得多（图1g），这一结果与细茎驼蹄瓣茎最厚而驼蹄瓣茎最薄的结果一致（图1f）。此外，细茎驼蹄瓣和长梗驼蹄瓣的叶子明显比驼蹄瓣的厚（图1i），表明它们的叶子相比驼蹄瓣可能具有更强大的储水能力。以上结果表明，与驼蹄瓣相比，细茎驼蹄瓣可能具有更强的运输茎部的水分并储存在叶子中的能力。
图1 三种驼蹄瓣属植物的组织学分析。细茎驼蹄瓣(a)、长梗驼蹄瓣(b)和驼蹄瓣(c)主茎的横截面分析。细茎驼蹄瓣(d)、长梗驼蹄瓣(e)和驼蹄瓣(f)叶片的横截面分析。(g)主茎木质部、韧皮部和皮层厚度的统计学分析。(h)主茎厚度的统计学分析。(i)叶片厚度的统计学分析。比例尺：(a)、(b)和(c)为0.2mm；(d)、(e)和(f)为0.1mm。所有的值均取自三个重复的平均值±标准差，根据Duncan多重比较，不同字母代表具有显著差异(P<0.05)。
2 三种驼蹄瓣属植物的耐盐性
作为荒漠植物，驼蹄瓣属植物对非生物胁迫具有良好的抵抗能力。为了探究三种驼蹄瓣属植物对盐胁迫耐受性的差异，研究者对三种植物的幼苗分别用0（control，CK）、50、100、150、200mM NaCl进行处理。相比于对照组，随着盐浓度的增加，三种驼蹄瓣属植物均表现出不同程度的枯萎，其中驼蹄瓣的叶子枯萎程度最高，而细茎驼蹄瓣程度最低（图2a，b）。此外，长梗驼蹄瓣和驼蹄瓣的幼苗在50mM NaCl条件下生长受到明显的抑制（图2a）。随着盐浓度的进一步增加，驼蹄瓣幼苗开始死亡，且存活率急剧下降（图2a，c）。相反地，即使在150mM的NaCl浓度条件下，细茎驼蹄瓣幼苗的存活率依然是最高的（图2c）。以上结果表明，细茎驼蹄瓣对盐胁迫具有更强的耐受性，而驼蹄瓣的耐受性最弱。
图2 三种驼蹄瓣属植物盐耐受性分析。(a)0（CK，control）、50、100、150和200mM NaCl处理的三种驼蹄瓣属植物的表型分析，比例尺=10cm。(b)三种驼蹄瓣属植物叶片枯萎的占比。(c)三种驼蹄瓣属植物存活率的统计学分析。
在盐的胁迫下，植物中的一些生理指标也会受到影响，例如脯氨酸、丙二醛（MDA）和叶绿素的含量，以及超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）和过氧化物酶（POD）活力。用NaCl处理两周后，研究者测量了不同盐浓度处理的三种驼蹄瓣属植物的这些生理指标。结果显示，随着盐浓度的增加，MDA含量急剧下降，其中细茎驼蹄瓣和长梗驼蹄瓣尤为明显，而驼蹄瓣则下降得稍缓（图3a）。然而，驼蹄瓣中叶绿素含量下降得最快，细茎驼蹄瓣最慢（图3b）。当盐浓度高于100mM后，细茎驼蹄瓣中脯氨酸含量显著增加，而盐浓度高于150mM时，长梗驼蹄瓣中得脯氨酸含量才表现出这一趋势，且增加的程度不如细茎驼蹄瓣。有趣的是，盐浓度高于150mM时，驼蹄瓣中脯氨酸的含量开始显著降低（图3c）。随着盐浓度的增加，三种驼蹄瓣属植物的CAT活力均出现降低，其中驼蹄瓣降低的程度最大而细茎驼蹄瓣最小（图3d）。除此之外，驼蹄瓣的SOD和POD活力也出现明显下降，而细茎驼蹄瓣和长梗驼蹄瓣的SOD和POD活力无显著变化（图3e，f）。以上结果表明，细茎驼蹄瓣的耐盐性（ST）最强，而驼蹄瓣对盐胁迫最敏感（SS）。
图3 三种驼蹄瓣属植物在盐胁迫下各项生理指标的测定。不同NaCl浓度处理后三种驼蹄瓣属植物叶片中的MDA含量(a)、叶绿素含量(b)、脯氨酸含量(c)、CAT活力(d)、SOD活力(e)和POD活力(f)。
3 盐诱导耐盐（ST）种气孔关闭
气孔的运动能调节光合作用和蒸腾作用，在植物调控生长发育以应对高盐和干旱等非生物胁迫过程中具有重要作用。为了探究耐盐（ST）种和盐敏感（SS）种在盐处理后气孔运动的不同，用150mM NaCl处理ST和SS幼苗（10叶期）24小时，然后取主茎上同一部位的叶片用扫描电子显微镜（SEM）观察。结果显示，对照组（CK）与盐处理组每平方毫米叶片上气孔数量无显著性差异（图4a-e）。同时也测量了对照组和盐处理组的气孔开放率。结果显示，对照组气孔开放率为80%，而ST气孔开放率仅20%，SS为60%（图4f）。以上结果表明ST在盐胁迫下气孔开放率的锐减有利于其叶片中水分的保留。
图4 ST和SS驼蹄瓣属植物叶片表面差异的扫描电镜（SEM）分析。150mMNaCl处理10叶期幼苗24小时后，用SEM观察其叶片表面；用0mMNaCl(a)和150mM NaCl(b)处理后的ST种叶片表面。用0mMNaCl(c)和150mM NaCl(d)处理后的SS种叶片表面，比例尺=50μm。气孔数目(e)和气孔开放率(f)的统计学分析。
4 ST和SS间差异表达基因（DEGs）分析
为了揭示ST和SS耐盐性出现差异性的潜在机制，我们构建了CK和150mM NaCl处理的根和叶的24个RNA-seq文库（三个生物学重复）。每个样本生成4380-6520万个高通量RNA-seq的原始数据读取（附件1：表S1）。删除适配器、ploy-N和低质量读取后，每个样本仍有高达4270万个读取量，其中每个样本约有62.63-83.73%的读取可以通过软件RSEM定位到拟南芥参考基因组上（附件1：表S1），再通过Trinity平台对498605个单基因进行重组，这些单基因的长度在201-37056 bp范围内，平均长度为1038bp（附件1：表S2），其大小分布在附件1：图S1中有说明。构建的单基因数据集储存在国家生物技术信息中心（NCBI）中，将作为进一步分析的参考。
用R包DESeq2分析对照和NaCl处理组间的DEGs（P<0.05，|log2FoldChange| > 1）。相比于对照组，盐处理组ST中根和叶分别存在10392和8088个DGEs，而SS种的根和叶中的DEGs数量分别为66743和5272（附件1：图S2）。与各自的对照相比，在盐处理后的ST和SS植物的根和叶中分别发现了4178和322个重叠DEGs（图5a）。盐处理后，根（附件1：图S4A）和叶（附件1：图S3A）中很多DEGs的表达均开始减少或受到诱导。GO分析表明，叶片中的DEGs大部分都具有序列特异性DNA结合、核酸结合转录和转录因子活性等分子功能（附件1：图S3B），而根的DEGs主要与细胞成分类别有关，如细胞、细胞组分和胞内（附件1：图S4B）。KEGG途径富集分析显示叶片中的DEGs显著影响了植物激素信号传导、氮代谢和二羧酸代谢（附件1：图S3C）；而根的DEGs仅仅影响植物激素信号的传导（附件1：图S4C）。此外，根（附件1：图S5C，D）和叶（附件1：图S5A，B）的一些DEGs的表达通过qRT-PCR验证，结果表明，90%以上基因的表达水平与RNA序列的FPKM值一致。以上结果表明，DEGs可能影响根和叶中的植物激素水平，进而影响驼蹄瓣属植物的耐盐性。
5 驼蹄瓣属植物中与耐盐性相关的候选基因
为了进一步筛选出与耐盐性相关的候选基因，将根和叶对照组与处理组的DEGs结合起来分析，发现在根和叶中仅仅只有11个重叠DEGs，且表现出不同的表达模式（图5a，b）。其中有两个基因（簇113，084.52599和簇113,084.52595）在根和叶中均表现为盐处理组表达量高于对照组（图5b），表明这两个基因受盐的诱导，且SS中的诱导效果尤为明显。基因功能注释显示这两个基因均编码支链氨基酸转氨酶（BCAT，表1）。GO分析显示，这11个重叠基因主要富集在生物过程上，尤其是代谢过程（图5c）。KEGG途径分析表明，11个重叠DEGs中的BCAT基因显著富集于缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸的生物合成，以及泛酸和辅酶A（CoA）的生物合成通路（表1，图5c）。这11个重叠DEGs的表达水平通过qRT-PCR验证，结果显示，不同组中这些基因的表达趋势于FPKM值一致。此外，盐胁迫能极强地诱导两个BCAT基因表达，且SS中表达量最高（图6）。以上结果表明，两个BCAT基因可能通过影响缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸的生物合成，以及泛酸和CoA的生物合成通路来调节驼蹄瓣属植物耐受盐胁迫，是驼蹄瓣属植物中与耐盐性相关的候选基因。
图5 ST与SS的根和叶的DEGs分析。(a)对照组与盐处理组重叠DEGs，其中L指叶片，R指根，T指用150mM NaCl处理组，CK为对照组。(b) ST与SS的11个重叠DEGs的表达模式，热图代表标准化的FPKM表达值。(c)11个重叠DEGs的GO分析。(d) 11个重叠DEGs的KEGG通路分析。
表1 ST和SS的11个重叠基因的功能注释。NA表示未得到代谢通路。
图6 11个重叠DEGs表达水平的qRT-PCR验证。L：叶片；R：根；T：用150mM NaCl处理；CK：对照（不添加NaCl）。所有的值均取自三个重复的平均值±标准差。
6 ST和SS种间差异的代谢组学分析
由于ST和SS的11个重叠DEGs的GO分析显示代谢过程显著富集，故作者比较了SS和ST叶片在CK和150mM NaCl胁迫条件下的代谢图谱。为了确保实验数据和结果的可信度，每组设置了6个重复。从包括ST和SS在内的所有样本种共鉴定出了315种代谢产物，利用主成分分析（PCA）可将SS和ST的对照组和实验组分开（图7a）。与对照组相比，在ST和SS的盐处理组叶片中分别鉴定出了70种和55种差异富集的代谢产物，其中8种在ST和SS两种植物中均表现为上调，有11种均表现为下调（图7b，c）。另外有9种差异富集的代谢产物在ST和SS中表现为相反地调节模式（图7d）。而随后对28种重叠的差异富集代谢产物进行KEGG分析，发现主要富集在泛酸和CoA生物合成通路中（图7e）。在盐的胁迫下，一种CoA合成通路中的重要中间产物3-甲基-2-乙酰乙酸酯在ST中上调，而在SS中下调（附件1：图S6A）。此外3-甲基-2-乙酰乙酸酯在BCATs的作用下能产生缬氨酸，而SS中的缬氨酸在盐的胁迫下表现为上调（附件1：图S6B）。与对照组相比，ST盐处理组的CoA含量无显著性差异，但SS盐处理组CoA含量出现明显的下调（附件1：图S6C），表明CoA含量对于驼蹄瓣属植物的耐盐性非常重要。
为了鉴定与叶片生理特性相关的DEGs，本研究对134个DEGs和42种代谢产物进行了两组相关分析（ST盐处理组与ST对照组和SS盐处理组与SS对照组）。对照和盐胁迫条件下ST的代谢物相关分析结果显示，大部分泛酸和CoA的生物合成信号相关基因与3-甲基-2-乙酰乙酸酯呈正相关，且3-甲基-2-乙酰乙酸酯与大部分植物激素信号转导、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸代谢，以及淀粉和蔗糖代谢相关基因呈正相关（图8），而SS的结果正好相反（附件1：图S7）。这表明盐胁迫可以诱导ST中一系列代谢通路相关基因上调，最终导致3-甲基-2-乙酰乙酸酯的含量增加，使得在ST中保持较高的CoA含量。因此，泛酸和CoA生物合成途径可能在驼蹄瓣属植物耐盐调控中发挥着重要作用。
图7 SS和ST种间差异的代谢组学分析。(a)对照和盐胁迫条件下ST和SS代谢图谱的主成分分析（PCA）。括号中为变异数比例，QC为质量控制（quality control）。(b)对照和盐胁迫条件下ST和SS中上调代谢产物的重叠。(c)对照和盐胁迫条件下ST和SS中下调代谢产物的重叠。(d)利用欧几里德距离测度（Euclideandistance measure）和聚类平均（average clustering）算法，将所选重叠差异富集代谢物的Log2（倍数变化）绘制成的热图。(e)重叠差异富集代谢物的KEGG分析，T：用150mM NaCl处理；CK：对照（不添加NaCl）。
图8 对照组与盐胁迫条件下ST的叶片生理特性与DEGs的相关性分析。用134个 DEGs和42种代谢物进行相关矩阵分析。相关系数（正或负）通过颜色反应，图例见右上角。
结论
图9 驼蹄瓣属植物耐盐机制模型。红色上箭头表示上调，蓝色下箭头表示下调。
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