科研 |INT J MOL SCI：水稻转录数据系统分析其对冷胁迫的响应和昼夜节律揭示与多种生物过程相关的分子网络
编译：夕夕，编辑：景行、江舜尧。
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水稻（Oryza sativa L.）是一种主要的农作物，是大约50％的人口热量的主要来源，它对温度胁迫表现出各种生理反应，这些响应通过与内在生物钟的串扰进行灵活的适应。然而，这种潜在的串扰的分子调控网络还知之甚少。因此，作者进行了系统的转录组数据分析，以鉴定参与冷应激反应和昼夜节律模式的基因。在这里，研究者首先确定冷调节基因，然后从这些基因中确定昼夜节律基因。将冷反应性昼夜节律基因定义为CD基因。通过KEGG和GO富集分析进一步分析了这些CD基因的功能特征，并进行了文献检索以鉴定功能特征性CD基因。随后发现参与光合作用的光捕获复杂蛋白与串扰强烈相关。此外，研究者构建了包含四个核心基因的蛋白质-蛋白质相互作用网络，并分析了Stay-Green （SGR）基因在调节与sgr突变体的串扰中的作用。研究者预测这些发现将为理解作物对气候变化的环境胁迫响应提供新的见解。
论文ID
原名：Systematic Analysis of Cold Stress Response and Diurnal Rhythm Using Transcriptome Data in Rice Reveals the Molecular Networks Related to Various Biological Processes
译名：水稻转录数据系统分析其对冷胁迫的响应和昼夜节律揭示与多种生物过程相关的分子网络
期刊：International Journal of Molecular Science
IF：4.556
发表时间：2020年9月
通讯作者：Ki-Hong Jung
通讯作者单位：庆熙大学生物技术与作物生物技术研究所
DOI号：10.3390/ijms21186872
实验设计
结果
为了系统分析未知的冷胁迫响应和昼夜节律的分子机制，研究者鉴定了响应冷胁迫和昼夜节律表达模式的候选基因（以下称为冷应答昼夜节律基因；CD基因）。利用由干旱、盐、冷和淹水等四种非生物胁迫组成的元表达数据集，鉴定了水稻对冷胁迫反应特有的基因。研究者鉴定出885和572个冷响应基因分别上调或下调至少2倍。接下来，利用自然田间条件下水稻叶片的Agilent 44K芯片数据分析了这些基因的日表达模式，包括营养期、生殖期和成熟期，每个发育阶段每2天间隔2小时。最后，分别鉴定了119个和346个CD上调/下调基因，昼夜节律表达模式如图1，这些基因被用于进一步的分析。
图1. 具有昼夜节律表达的冷调节基因的热图。（A）鉴定到885个上调表达基因，其中有119个表现出昼夜节律。（B）鉴定到572个下调表达基因，其中有346个表现出昼夜节律。对冷处理敏感的昼夜节律基因用红色表示。DAT代表移植后天数。
2 鉴定CD基因的功能特性
为了探讨CD基因的功能作用，研究者从水稻数据库中检索功能特征基因的信息。对于上调表达的CD基因，已报道了14个基因的功能，其中有4个基因是水稻碳分解代谢物抑制因子，4个基因与冷胁迫耐受相关，1个与稻瘟病抗性有关，1个与干旱耐受有关，3个与矮态有关，2个与开花时间有关，3个与花器官鉴定有关。此外，鉴定的13个下调表达的CD基因有已知功能。其中2个与抗细菌性白叶枯病有关，2个与稻瘟病抗性有关，1个与干旱耐受有关，3个与矮态有关，1个与开花时间有关。这些结果表明，冷胁迫相关的上调表达基因冷应激反应比下调表达基因更显著。此外，这些结果也表明CD基因不仅与低温等非生物胁迫有关，还与生物抗性、衰老和发育等过程有关（表1）。
表1. 水稻冷响应日变化节律基因(CD基因)功能特征列表
3 KEGG和GO富集分析表明光合作用和光富集与冷应激反应和生物钟密切相关
为了进一步探索参与生物钟与冷胁迫响应相互干扰的基因的生物功能，研究者进行了GO和KEGG富集分析，共富集了生物学过程中的21个GO terms（图2A）。上调表达的CD基因富集的7个GO terms分别为：深水反应（GO:0030912），胁迫反应（GO:0006350），多糖分解过程（GO:0000272），蛋白质氨基酸去磷酸化（GO:0006470），多细胞生物发展（GO:0007275），转录（GO:0006350），转录调控（GO:0045449）。下调表达的CD基因富集的14个GO terms分别为：细胞分裂素代谢过程（GO:0009690），光合作用和光富集（GO:0009765），RNA剪接（GO:0008380），rRNA加工（GO:0006364），RNA加工（GO:0009765），细胞蛋白质代谢过程（GO:0044267），四环素运输（GO:0015904），纤毛和鞭毛运动（GO:0001539），抗生素反应（GO:0046677），蛋白质折叠（GO:0006457），胁迫反应（GO:0006950），细胞氨基酸生物合成过程（GO:0008652），离子转运（GO:0030001），1型超敏反应（GO:0016068）。
除了GO富集分析，还进行了KEGG富集分析来鉴定冷胁迫和生物钟机制下的代谢通路。有趣的是，只有光合作用-触角蛋白质通路被富集（图2B）。使用KEGG mapper软件，研究者鉴定了该途径中涉及的三种光富集蛋白（图2C）。这些结果在光合作用和主要与冷胁迫响应和昼夜节律有关的光收集过程方面是一致的，这也在MapMan软件的得到了证实。
图2. GO和KEGG分析CD基因的功能分类。（A）共有465个基因注释到生物学过程。点的颜色代表富集倍数（蓝色代表2倍，红色代表大于2倍），点的大小代表显著性。（B）KEGG富集分析的候选基因。点的大小代表富集到该条通路的基因占总基因个数的比例，点的颜色代表p-value。（C）使用KEGG mapper webtool可视化与光捕获叶绿素蛋白复合物有关的下调CD基因。
4 CD基因蛋白-蛋白相互作用的构建揭示了分子网络与各种生物过程的相互作用
为了进一步探索冷胁迫反应和生物钟之间分子机制，研究者使用水稻互动viewer构建了PPI网络。该viewer生成了一个CD基因构建的网络，共有764个节点和1340条边。然而，由于其复杂性，研究者又重新构建了网络，只显示基因的相互作用，重构的网络有208个节点和248条边（图3）。
图3. CD基因构建的PPI网络。使用Rice Interations Viewer构建所有CD基因的PPI网络。该网络图去除了没有功能注释的基因。
在上调的CD基因中，有7个在网络节点上。OsBZR1是水稻的一个关键的转录调控因子。另一个基因OsMAPK5中的增殖蛋白激酶是ABA的诱导因子，可以调节疾病抵抗和生物胁迫耐受。在下调的CD基因中，有2个已知基因在节点上：Wx和OsHDA702。
5 冷应激响应的验证
在冷胁迫响应与昼夜节律相互作用的功能特征基因中，sgr突变体在叶片衰老期间保持绿色。经过4天的冷胁迫和4天的恢复，研究者发现sgr突变体比对照植株Dongjin rice (DJ)表现出更耐冷胁迫的表型（图4A）。此外，在与sgr突变体相同的遗传背景下，通过重复实验证实了这种耐药表型并非源于发育效应。冷处理后SGR基因表达上调，使用qRT-PCR对其表达模式进行验证（图4B）。验证了PPI网络中的4个核心基因，分别为OsMAPK5,OsSNPK1a,OsPhyB和OsHDA702（图4C）。这4个基因在sgr突变体中均上调表达，sgr突变体在冷胁迫下也表现出4个核心基因表达水平的改变。这些结果表明一些生物过程，包括冷胁迫响应可以通过PPI网络模型中的核心基因联系起来。
图4. 冷胁迫下sgr突变体与野生型对照的表型，以及sgr在调控网络中的作用。（A）冷胁迫下DJ和sgr表型比较。（B）验证冷胁迫和昼夜节律下SGR基因的差异表达模式。OsGI，rice gigantea基因作为昼夜节律的marker基因，其在夜间表现峰值。（C）冷胁迫的核心基因OsMAPK5,OsSnRK1a,OsPhyB和OsHDA702在DJ和sgr冷胁迫处理4天后的表达水平。
讨论
寒冷威胁着各种主要作物的正常生长和产量需求。昼夜节律有节律地控制植物的行为和生理活动，以提高植物对环境的适应能力。在模式植物拟南芥(Arabidopsis thaliana)中，人们对生物钟、光质量和冷反应之间的相互作用进行了深入研究。此外，光感受器:ZEITLUPE，光敏色素和隐花色素，它们受到巨噬细胞蛋白的调控，将光质量信息与生物钟结合在一起。在水稻中，利用同源基因搜索已经报道了生物钟基因，但主要是对农艺性状特别是开花时间的深入研究。对这一特性以及水稻的地理分布的研究表明，生物钟与冷胁迫之间存在关系，但是，在拟南芥中塑造分子网络的报道仍然有限。因此，通过对水稻冷胁迫反应与生物钟的系统分析，探讨其可能的相关性具有重要的发展意义。
研究者首先确定了465 CD基因,其中包括119调节和346个基因表达下调。这些是通过利用公共数据库的转录组分析发现的，这提供了可能提高水稻耐寒性的更广泛的效用范围。这些基因将作为后续一系列研究的基础。
为了理解水稻冷胁迫反应和昼夜节律之间的串扰背后有意义的生物学过程，研究者进行了GO和KEGG富集分析。基于可视化结果，发现光合作用和光采集是与冷胁迫反应相关的水稻关键生物过程。以往的研究也表明光合作用对冷胁迫反应和生物钟的重要性。然而，关于光合作用和冷胁迫与生物钟的串扰效应的研究仍然有限。网络分析提示了一个假想的分子机制，该机制隐藏在冷胁迫反应和生物钟调节之间的相互干扰的不同现象之下。
总的来说，不同生理反应(如寒冷)和生物钟之间的相互联系是通过操纵核心基因的表达实现的。此外，研究者还构建了一个通过核心基因相互连接的多个元素的网络（图5），但仍然需要进一步实验验证该假设，然而，本研究提供的数据将为研究冷胁迫和生物钟提供桥梁。
图 5. 冷应激枢纽基因介导的不同生物过程之间串扰的假想模型
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