科研 | Nature ：微生物群中究竟谁是导致疾病发生的幕后黑手（第四期文献包投票选出的文章）
本文由李苗苗编译，董小橙、江舜尧编辑。
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微生物全基因组关联研究（MWAS）已经确定了许多疾病与微生物群变化息息相关。这些研究通常会产生一系列作为疾病生物标记的共生菌，与疾病的发病机制无明显关联。如果该领域欲超越相关性研究并开拓因果关系研究，则需要一个行之有效的系统来精炼差异丰度微生物的目录，也方便随之而来的机理研究。在此，我们证明，微生物-表型关系的三角定位是一种可以排除微生物群研究中固有的干扰并定位致病微生物的行之有效的方法。我们发现携带不同微生物群的悉生小鼠在结肠炎模型中表现出不同的存活率。让这些小鼠共处一室造就了携带杂合微生物群并且对结肠炎中度敏感的动物类型。在亲本小鼠品系和杂合微生物小鼠中通过定位微生物-表型关系确定了毛螺菌科Lachnospiraceae与疾病防御相关。通过定向微生物培养技术，明确了一种该菌科前所未闻的肠道微生物Clostridium immunis，当施用于易患结肠炎的小鼠时，保护它们免于结肠炎导致的死亡。为了证明此方法的普遍性，我们用它来鉴定几种诱导抗菌肽肠道表达的共生菌。因此，我们通过微生物-表型三角定位方法超越了标准的相关微生物组研究，并确定了两种完全不同的表型的致病微生物。通过微生物-表型三角定位鉴定调节共生体的疾病可以更广泛地应用于人类微生物组。
原名：Moving beyond microbiome-wide associations to causal microbe identification
译名：超越微生物全基因组关联研究寻找肠道微生物与疾病的真正关系
期刊：Nature
IF：41.577
发表时间：2017年
通信作者：Dennis L. Kasper
通信作者单位：美国哈佛医学院微生物学与免疫生物学系
实验设计图
先前，我们生成并表征了用小鼠微生物群（MMb）或人类微生物群（HMb）定殖的悉生小鼠。我们使用化学诱导的肠炎模型探索了小鼠对结肠炎的易感性不同。我们发现，与无菌小鼠相似，MMb小鼠对葡聚糖硫酸钠（DSS）诱导的结肠炎非常敏感，体重严重减轻和100％的死亡率（图1a，b）。相比之下，HMb和无特定病原体（SPF）小鼠体重明显减轻，很少死亡（图1a，b）。这种存活分歧并未反映出HMb或SPF小鼠中缺乏结肠炎症：炎症程度在第5天没有差异。然而，在第10天，MMb小鼠的炎症比SPF或HMb小鼠稍严重（图1c））。
我们比较了HMb和MMb小鼠的粪便微生物群，试图确定负责调节疾病严重程度的微生物。鉴于这些小鼠具有不同的潜在微生物来源，我们并不惊讶地发现超过150种细菌类群丰度在两组之间存在差异（扩展数据图1a）。MMb和SPF小鼠的粪便微生物的比较证明了大约100种丰度差异的细菌类群（扩展数据图1b）。在这两种情况下，有牵连的微生物数量之多，使得优先和追求潜在的引线极具挑战性。聚焦在MWAS中检测到的一些最富有差异的生物体已经发现了一些与表型有因果关系的少数微生物。在HMb和MMb小鼠中使用这种方法，我们确定了一组中存在26个分类群而另一组中不存在。我们选择了其中四种，口服给缺乏它们的HMb或MMb小鼠，并用DSS攻击小鼠。没有小鼠显著增加结肠炎的严重程度（扩展数据图2）。该结果突出了仅依赖于可被二分为存在或不存在的生物的挑战。
图1 MMb小鼠比HMb小鼠具有更严重的结肠炎
为了确定微生物群在DSS诱导的结肠炎易感性中是否占优势，我们共同饲养HMb和MMb小鼠3周。与MMb小鼠共同饲养的HMb小鼠（HMbMMb-3w）和与HMb小鼠共同饲养的MMb小鼠（MMbHMb-3w）具有中间表型（图2a），这表明了微生物的双向转移。为了限制微生物变化的程度，我们定义了产生表型差异的最短共存期，共同饲养HMb和MMb小鼠1或3天，然后将两组分开。我们在共室第14天用DSS攻击小鼠，以留出生理变化的时间。令人惊讶的是，1天的共同饲养足以引起显著的存活差异，并且共室处理持续时间具有剂量依赖性效应（图2b，c）。
随着DSS诱导的疾病严重程度的差异，我们在共同饲养1天的小鼠（HMbMMb-1d，MMbHMb-1d），亲本小鼠品系（HMb，MMb）和SPF小鼠中发现了独特的粪便微生物群（图2d）。我们在四个成对比较中鉴定了差异丰度的细菌，包括微生物相关的小鼠对和两对疾病严重程度不同的小鼠。每个成对分析（代表一个MWAS）产生大约60-160个差异丰度的细菌类群（图2e和扩展数据图1a-d）。我们推断，如果任何分类群与疾病发病机制真正相关，它们将存在于所有四个比较中。其中唯一的类群是Lachnospiraceae。革兰氏阳性、厌氧及非芽孢产生的这个科与DSS诱导的结肠炎的存活相关；其丰度在MMB小鼠中可忽略不计，在SPF和共室处理的小鼠中处于中等水平，而在HMb小鼠中较高（图2F）。有趣的是，Lachnospiraceae已在多项人体研究中被鉴定为与肠炎呈负相关，尽管这种关联的重要性仍未知。
图2 微生物-表型三角定位揭示Lachnospiraceae菌科与结肠炎的存活相关。
为了明确这个分类群是否与提高的存活率有因果关系，我们培养了HMb小鼠（HMb cx）的粪便，在半选择性培养基上获得了大约五倍的富集;培养的细菌聚生体包括约40％的Lachnospiraceae（图3a）。作为对照，我们在相同的半选择培养基上培养MMb小鼠（MMb cx）的粪便，并且未发现Lachnospiraceae的富集，这一发现与MMb小鼠中其不显著数量一致（扩展数据图3）。我们将这些细菌培养物口服给予易患结肠炎的MMb小鼠，以确定Lachnospiraceae是否可以预防结肠炎相关的死亡。尽管给予MMb cx的所有MMb小鼠都死亡，但给予HMb cx的MMb小鼠受到显着保护（图3b）。这两组的微生物群不同（扩展数据图4）;从HMb小鼠接受细菌的MMb小鼠具有更丰富的Lachnospiraceae（图3c）。为了确保增加的存活率特别是由于施用的细菌而不是预先存在的MMb微生物群的无关变化，我们用HMb cx定殖无菌小鼠;它们同样受到保护免于结肠炎相关死亡（扩展数据图5）。
图3 C. immunis保护MMb 小鼠免于结肠炎
为了证明其普遍性，我们使用微生物-表型三角定位法来鉴定诱导肠道表达Reg3γ的共生菌，Reg3γ是维持上皮层和微生物群之间空间隔离的关键抗菌肽。虽然已知共生微生物是诱导Reg3γ表达所必需的，但很少有特定的生物体被定义。在我们最近发表的关于分类学上不同的共生微生物的免疫调节能力的综合分析中，28种细菌对RG3γ的小肠表达都没有显著的诱导作用。我们以前证明，HMb小鼠的回肠水平Reg3γ表达与无菌小鼠相似，且低于MMb小鼠。我们现在发现HMbMMb-1d小鼠中的Reg3γ表达恢复到与MMb小鼠相当的水平，而MMbHMb-1d小鼠中没有观察到变化（图4a）。使用微生物-表型三角定位方法，通过两个成对比较我们确定了丰度差异的分类群，但在MMb和MMbHMb-1d小鼠之间没有变化（图4b）。因此，我们将相关微生物列表细化为七个分类群，其中三个（Ruminococcus gnavus活泼瘤胃球菌，Lactobacillus reuteri罗伊氏乳杆菌和分段丝状细菌（SFB））对物种水平表现出生物信息学分辨率（图4b和扩展数据表1）。
用R. gnavus或L. reuteri处理的HMb小鼠具有比对照更高的回肠Reg3γ表达（图4c）。先前的证据表明SFB在无菌和SPF小鼠中诱导Reg3γ表达证实了使用我们的特异性悉生小鼠获得的结果具有更普遍的适用性。我们要求MMb和MMbHMb-1d小鼠之间的生物体保持不变，成功地排除了Reg3γ表达与阴道乳杆菌Lactobacillus vaginalis之间的关系，L. vaginalis是罗伊氏乳杆菌L. reuteri的近亲，在HMb小鼠中也不存在（扩展数据图6）。尽管集中在群体之间高度分化的分类群可能表明罗伊氏乳杆菌L. reuteri和SFB（在MMB小鼠中丰度仅分别为0.2%和0.3%，而在HMB小鼠中不存在）与Reg3γ诱导相关，另外两个分类群仅存在于MMb小鼠中不影响Reg3γ表达（扩展数据图6）。此外，我们的方法提供了表型定向结果。尽管我们对两种表型使用相同的数据集，但Reg3γ诱导的分类群对结肠炎模型没有影响（扩展数据图2）。总之，微生物-表型三角定位可以帮助鉴定与两种不同结果有因果关系的分类学多样性微生物。
图4 R. gnavus和L. reuteri诱导Reg3γ的肠道表达
我们的结果描绘了一种生物信息学上直截了当的方法，可用于可能致病的特定微生物群成员的三角定位。来自多组微生物相关小鼠的微生物群分析的组合允许我们交换敏感性以增加特异性。在结肠炎和Reg3γ例子中，我们通过生物信息学确定了与我们的表型相关的数量有限的分类群，并通过回溯实验证实了其相关性，以满足科赫法则。尽管科赫法则及其现代修订版传统上仅适用于病原体鉴定，但我们关于疾病保护共生菌的研究结果符合其所有主要原则。随着微生物组研究趋于成熟，越来越多的微生物可能与疾病的保护有关。我们建议将科赫法则扩展到有益生物的鉴定，从而确保对益生菌的新兴研究具有与微生物发病机理研究所需的相同程度的科学严谨性。
我们的微生物-表型三角定位方法可能更普遍适用于人类微生物组研究。对参与者和控制进行周密的选择可以避免日益大规模，复杂的研究设计，同时实现有意义的比较分析。此外，可以通过该方法分析来自其他“-omics”数据集（例如，转录组学，宏基因组学，代谢组学）的结果，以改进结果列表并随后确定哪些与表型有因果关系。微生物表型三角定位方法可能无法识别所有与疾病相关的微生物，特别是那些影响甚微的微生物，但我们认为它是一种有用的工具，有助于发现关键疾病调节的微生物组分。
微生物-表型三角定位方法推动了微生物组学研究从关联走向因果，扫除了微生物组研究的一大障碍，开创了微生物组研究的新时代。三角定位方法成功地梳理了肠道细菌与疾病的因果关系，可以将致病菌聚焦到细菌物种水平，鉴定出调节疾病的特定微生物。该方法有望广泛应用于人类微生物组研究。