动物行为实验方法硬核总结（2）：Morris水迷宫实验

本文接上一篇文章！，主要对Morris水迷宫实验的统计方法、注意事项、适用范围等方面进行多维度分析介绍！

四、统计方法学准则

潜伏期时间为计量资料，可用方差分析，但需按方差分析的程序先进行方差齐性检验，方差齐，计算F值，用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计；对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换，待满足正态或方差齐要求后，用转换后的数据进行统计；若变量转换后仍未达到正态或方差齐的目的，改用秩和检验进行统计。计数资料，比如说穿越站台的次数，可用X2检验，四格表总例数小于40，或总例数等于或大于40但出现理论数等于或小于1时，应改用确切概率法。

Morris 水迷宫的实验数据较为复杂，其统计分析难度也较大，尤其是对大鼠在寻找隐蔽站台试验中所测得的逃避潜伏期如何进行统计学分析既往存在的问题较多。在过去的研究中，国内文献中有的直接计算每天的平均逃避潜伏期后再进行t检验或方差分析，或根据大鼠的逃避潜伏期在定位航行试验后3d趋于稳定的情况，仅对后3d的平均逃避潜伏期进行t检验或方差分析。有的研究则就1～5d的逃避潜伏期进行单因素方差分析。我们认为以上统计方法均不正确。一个较明显的错误是，以趋于平稳的后3d的平均逃避潜伏期代表记忆水平，首先遇到的问题是仅在生理状态下的大鼠才表现如此，而实验记忆损伤组大鼠往往后3d的逃避潜伏期仍然持续下降。正常青年组和初老年组大鼠的逃避潜伏期在后3d趋于平稳，但实验损伤组大鼠的逃避潜伏期由于学习记忆损伤后其基线较高，第3～5天逃避潜伏期仍然呈下降的趋势，并不象正常对照组一样趋于稳定。

不仅如此，还存在上述统计方法对隐蔽站台试验中测得的逃避潜伏期数据统计学特征的认识错误。隐蔽站台试验中的逃避潜伏期具有以下特点：

①系重复测量设计，即在给予某种处理后，在不同的时间点上从同一受试对象上重复测量获得的数据(逃避潜伏期)；

②影响逃避潜伏期(自变量)统计分析结果的至少有动物组别、检测时点等多个效应因子，效应因子之间存在交互影响效应；

③同一受试动物的不同时间点所测得的逃避潜伏期存在高度的自相关性；

④存在截尾数据(最大潜伏期)。

据此，对Morris水迷宫中隐蔽站台试验的逃避潜伏期应采用重复测量数据repeated measures analyses of variance(ANOVA)的多因素方差分析结合截尾数据的生存分析方法较为恰当，国外文献报道中常用，这种方法对潜伏期均值进行进一步的分析，天数作为自变量，潜伏期或游泳速度作为因变量。

五、评价指标准则（指标仅针对于SuperMaze 软件/VisuTrack软件，根据软件版本有差异）

虽然文献中提到了纷繁复杂的评价指标，但对这些指标并没有进行很好的特征化和准则化。例如，游泳速度明显是运动能力的指标，路径长度又受游泳速度和游泳时间（潜伏期）的双重影响，理论上不应该是判断认知能力的很好指标。所以，对各项指标所反映的行为性质需要进行探讨，解释这些指标时要慎重。单用潜伏期作为指标并不能提供有关空间学习的足够信息，因为游泳速度快也并非意味着学习效率就高，记忆能力就好。

参数定义准则：

• 总路程（总活动度）：实验动物总的运动路程；

与动物自身的游泳速度直接相关，在相同的时间内，只反映动物的游泳速度的快慢；即路程越长，反映了动物的游泳速度越快。

• 总时间：开始录像到录像结束时实验动物在识别区域内出现的总观察时间；

即为单次的训练时间，一般现在为60s;

• 平均速度：总路程/总时间；

从中可以看出动物游泳速度的个体差异来，动物的潜伏期和游泳速度有一定的关系；

• 上台时间（潜伏期）：也叫成功潜伏期，指实验动物每次入水后第一次成功找到站台所需的时间；成功上台是指在台上逗留时间超过5～10秒钟（可自己定义），如果逗留时间不足5～10秒，则不算成功上台，潜伏期时间即为训练时间；

潜伏期是morris水迷宫一个很重要的参照指标，它的时间长短也代表着动物空间学习记忆能力的好坏，潜伏期短，预示着动物的学习记忆能力好；但是和动物自身的游泳速度有关，比如有的正常大鼠游泳速度慢些，所以潜伏期比痴呆组动物还长，另外，某些动物放入水中后会左右观望打圈，或者原地不动确定方向后直接游到台上，出现这种现象，说明动物记忆力好，这个现象是很重要的，如果在治疗组动物发现这种情况，是非常好的。但是由于动物原地不动，这个时候潜伏期的时间可能会长，所以潜伏期并不能作为判断记忆力好坏的最终指标。

• 上台前路程：指实验动物在第一次成功上台前所运动的路程；

与潜伏期时间相关，潜伏期时间越长，上台前路程也就越大；二者之间呈正相关系，所以也间接反映了潜伏期时间的长短，也可以看做是评定动物记忆力好坏的指标之一。

• 上台前平均速度：上台前路程/上台时间；

从中可以看出动物游泳速度的个体差异来，动物的潜伏期和游泳速度有一定的关系；

• 第一象限活动路程：实验动物在第一象限所活动的距离之和；

• 第一象限活动时间：实验动物在第一象限运动的时间之和；

• 第二象限活动路程：实验动物在第二象限所活动的距离之和；

• 第二象限活动时间：实验动物在第二象限运动的时间之和；

• 第三象限活动路程：实验动物在第三象限所活动的距离之和；

由于站台一般都放置在第三象限，在这个象限活动的路程越长，反映了动物的空间记忆能力比较好；

• 第三象限活动时间：实验动物在第三象限运动的时间之和；

由于站台一般都放置在第三象限，在这个象限活动的时间越长，反映了动物的空间记忆能力比较好；

• 第四象限活动路程：实验动物在第四象限所活动的距离之和；

• 第四象限活动时间：实验动物在第四象限运动的时间之和；

• 中心活动路程：实验动物在水池中心区域内活动的距离之和；

啮齿类动物游泳有绕边性和边缘性，而站台是在远离周边靠近水池中心的，如果动物改变了游泳路线在水池中心区域内活动的路程长的话，反映其空间记忆能力好。

• 中心活动时间：实验动物在水池中心区域内活动的时间之和；

啮齿类动物游泳有绕边性和边缘性，而站台是在远离周边靠近水池中心的，如果动物改变了游泳路线在水池中心区域内活动的时间长的话，反映其空间记忆能力好。

• 周围活动路程：实验动物在水池周边区域内活动的距离之和；

啮齿类动物游泳有绕边性和边缘性，而站台是在远离周边靠近水池中心的，如果动物在水池周边区域内活动的路程长的话，反映其空间记忆能力差。

• 周围活动时间：实验动物在水池周边区域内活动的时间之和；

啮齿类动物游泳有绕边性和边缘性，而站台是在远离周边靠近水池中心的，如果动物在水池周边区域内活动的时间长的话，反映其空间记忆能力差。

• 站台周围范围I活动路程：实验动物在站台周边区域I内活动的距离之和；

• 站台周围范围I活动时间：实验动物在站台周边区域I内活动的时间之和；

• 站台周围范围II活动路程：实验动物在站台周边区域II内活动的距离之和；

• 站台周围范围II活动时间：实验动物在站台周边区域II内活动的时间之和；

• 站台周围范围III活动路程：实验动物在站台周边区域III内活动的距离之和；

• 站台周围范围III活动时间：实验动物在站台周边区域III内活动的时间之和；

• 站台周围范围IV活动路程：实验动物在站台周边区域IV内活动的距离之和；

• 站台周围范围IV活动时间：实验动物在站台周边区域IV内活动的时间之和；

在站台周围范围活动的路程和时间越长，反映了动物的空间记忆能力好。

• 站台穿越次数：指在撤去平台后，在一定的时间内，实验动物穿越原站台位置的次数。（穿越一次指进出站台区域各一次）；

在一定的时间内，动物穿越原站台位置的次数越多，说明其空间学习记忆能力越好。

• 初始角(弧度)：指在将实验动物放入水池后，动物的运动轨迹的起始点的切线与起始点和站台中心连线之间的夹角；

如果初始角的角度越小，说明动物记得站台的位置，直接向站台方向游，反映空间学习记忆能力比较好。

• 入水点象限：实验动物入水时所处的象限；

搜索策略：

（1） 直线式：以实验动物入水点与站台中心连线为中轴，如果动物的所有运动轨迹与中轴的距离不超过半径的15%，且在该区域中运动的时间至少占总运动时间的70%则认为实验动物此次运动为直线式策略。

（2） 趋向式：与直线式较相似，以实验动物入水点与站台中心连线为中轴，如果动物的所有运动轨迹与中轴的距离不超过半径的50%，且在该区域中运动的时间至少占总运动时间的70%则认为实验动物此次运动为趋向式策略。

（3） 边缘式：以实验动物运动区域中心为圆心，取半径的75%做圆，如果动物70%以上的时间均在该圆外活动，则认为实验动物此次的运动为边缘式策略。

（4） 随机式：若实验动物的运动策略与以上三种不同则认为实验动物此次运动为随机式策略。

搜索策略和趋触性是衡量动物分析判断能力和解决问题能力的两个指标。大鼠寻找平台的方式大致可分为四种：边缘式、随机式、趋向式及直线式。不同的搜索方式代表大鼠以不同的策略寻找平台，正常动物的搜索策略随着训练次数的增加而呈现“边缘式→随机式→趋向式→直线式”的变化规律。痴呆动物的搜索策略会发生异常变化。比如只有边缘式→随机式，或者随机式→边缘式，趋向式和直线式比较少见。

直线式

趋向式    

边缘式

六、实验适用范围准则

与其他方法相比，Morris水迷宫在判定啮齿类动物认知功能中具有很多优点：

（1）它不需要实验前训练阶段，而且可以在短时间内完成相对大量的动物。

（2）由于对年龄相关性空间记忆损害有可靠的敏感性，Morris水迷宫是判断老年鼠空间学习记忆能力的特别有用的工具。通过探测和转移位置实验的训练，学习和回忆过程可以被记录分析，也可以在各组之间比较。

（3）虽然对于鼠类来说浸入水中是令其厌恶的，驱动动物逃避的是水刺激，而不需要食物剥夺和电击，因此，避免了剥夺食物给实验动物带来的新陈代谢和电击休克方面的问题，而这方面问题对某些品系的动物来说可能是危险的。

（4）气味或痕迹等干扰可以被去除。

（5）将实验动物的学习记忆障碍和感觉、运动缺陷等分离开来，减少它们对学习记忆过程检测的干扰。可见站台实验，可以识别可能影响实验结果的动物视觉缺陷，修正标准Morris水迷宫实验中得到的结果。

（6）通过改变站台的位置，可以完成学习和再学习实验，相应的，在同组动物中也可以测量不同用药量的效果。

（7）既可以检测空间参考记忆又可以检测空间工作记忆。在用固定平台测试小鼠的空间参考记忆后再将平台的位置改为不固定，就可检测它们的工作记忆能力。

（8）通过使用窗帘、划分区域等，可以减少实验人员和实验以外的物体对视频跟踪系统记录的干扰。

（9）能提供较多的实验参数，系统全面地考察实验动物空间认知加工的过程，客观地反映其认知水平，显然，寻找不固定平台的认知过程要复杂一些，需要动物对时间和空间上的分离信息加以整合和判断。

（10）操作简便，数据误差较小。

七、注意事项

1．对比食物驱动的模型（如放射臂迷宫），水迷宫实验的最大优点在于，动物具有更大的、逃离水环境的动机。而且不必禁食，特别适合老年动物的测试。加上它对衰老引起的记忆减弱尤其敏感，因此，水迷宫最常用于老年动物记忆的研究。

2．如用小鼠，除游泳池尺寸约为大鼠的50%以外，平台直径也较少（7.5cm）。实验方法与大鼠类似，但训练周期较短。一般获得性训练3天共训16次（第一天4次，后两天每天6次；两次训练之间的间隔5~10min，第四天为探查训练，第五、六天为对位训练，每天训练六次，第七天为第二次探查训练。

3.如用肉眼观察，在所有试验过程中试验始终坐在同一位置，距离泳池最近的边缘约60cm。

4．每天在固定时间测试。操作轻柔，避免不必要的应激刺激。

5．当与其他同类实验相比较时，要注意到动物的性别、品系、泳池的尺寸和水温等多种因素对实验结果的影响。此外，当以游泳速度作为观察指标时，要考虑到动物的体重、年龄以及骨骼肌发育状况等对游泳速度可能造成影响。

6．用老年动物进行实验时，应确认动物的游泳能力和视力不因年龄增大而影响行为操作。其方法如下：将平台露出水面以使动物能够看见平台。动物放入泳池后如毫无困难地直接游向平台，说明动物的游泳能力和视力均正常，可以开始实验。

7．游泳对动物是一个较大的应激刺激，可引起神经内分泌的变化。这些变化可能对实验结果造成干扰。对老年动物，严重时可诱发心血管疾病而导致卒中甚至死亡。因此，必要时可将动物多次放入泳池或适当延长其游泳时间以增加动物对游泳的适应能力。

8．当用牛奶或奶粉搅浑泳池的水时，要定期换水以免水腐败变质；