科研 | 西北农林大学Nature 子刊：肠道菌群介导的间歇性禁食可减轻糖尿病引起的认知障碍
编译：你知道，编辑：小菌菌、江舜尧。
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认知功能减退是2型糖尿病（T2D）的并发症之一。间歇性禁食(IF)是一种很有前途的减轻T2D症状的饮食干预方法，但其对糖尿病引起的认知功能障碍的保护作用尚不明确。本文发现，28天的IF疗法通过微生物-代谢-脑轴改善了糖尿病小鼠的行为障碍: IF增强了线粒体生物发生和海马内能量代谢基因的表达，重构了肠道菌群，改善了与认知功能相关的微生物代谢物。此外，通过整合模型进行评估，IF与基因，微生物和代谢物之间也存在着强烈的联系。用抗生素清除了肠道菌群可抵消IF对神经地部分保护作用。3-吲哚丙酸、血清素、短链脂肪酸或牛磺熊去氧胆酸在改善认知功能方面与IF作用相似。总之，本文研究旨在微生物-代谢-脑轴可作为一种对抗代谢相关的认知病理生理学的治疗机制。
论文ID
原名：Gut microbiota mediates intermittent-fastingalleviation of diabetes-induced cognitive impairment
译名：肠道菌群介导的间歇性禁食减轻糖尿病引起的认知障碍
期刊：Nature Communications
IF：11.878
发表时间：2020.02
通讯作者：刘志刚&刘学波
作者单位：西北农林科技大学
实验设计
1．将db/db 小鼠分为AL(ad libitum)饮食组和IF饮食组，①记录体重、摄食量以及饮水量变化；②进行行为测试分析；③多OMICS分析。
2．分别对db/db小鼠和db/m小鼠给予抗生素和IF的联合治疗，进行行为学和生化学层面的全面分析。
主要内容
2型糖尿病（T2D）的患病率在世界范围呈现上升趋势，并且认知障碍是T2D的一种严重并发症。导致认知障碍的病因来自糖尿病的因素是多方面的，包括脑胰岛素抵抗，脑微血管损伤和神经炎症。以前研究发现T2D相关或高脂肪饮食认知缺陷与脑胰岛素抵抗有关，葡萄糖摄取减少，神经递质代谢障碍和线粒体功能紊乱。
最近的研究强调了在糖尿病啮齿动物模型和人类中肠道菌群通过功能性微生物代谢产物的产生在调节全身胰岛素敏感性和能量代谢上的关键影响。此外，肠道菌群在联系饮食和宿主生理病理方面起着至关重要的作用。肠稳态对于维持肠道健康和通过调节血脑屏障通透性的认知功能，脑能量稳态和突触传递至关重要。值得注意的是，微生物群组成的个体差异和微生物代谢产物，例如短链脂肪酸（SCFA），3-吲哚丙酸（IPA），第二胆汁酸（BAs）和血清素（5-HT）是由基因型，宿主年龄和饮食模式所共同决定的。他们也是与全身的新陈代谢和功能密切相关，已被证明具有潜在的神经保护作用效果。BAs像牛磺去氧胆酸（TUDCA）被认为是一种潜在的预防肌萎缩的侧索硬化症和阿尔茨海默氏病（AD）的药物。另外，先前的研究表明IPA是一种色氨酸的微生物的脱氨基代谢产物，可能通过清除自由基对β-淀粉样蛋白诱导的神经元损伤具有神经保护作用的潜力。
饮食限制在代谢综合征和寿命延长方面的有益作用被广泛报道，并且肠道菌群可能在其中起着关键性的作用。间歇性禁食（IF）养生法是一种周期性的饮食限制，已显示可延长寿命，促进能量代谢并降低与年龄相关的各种病状发展的风险。在啮齿类动物模型中，IF可以通过调节肠道微生物组和微生物代谢物的组成来改善胰岛素抵抗，激活脂肪组织褐变，保护中枢神经系统自身免疫，并改善糖尿病相关的视网膜病变。此外，在动物模型中，IF被设计为隔日禁食已发现可改善与年龄相关和与阿尔茨海默氏病（AD）相关的神经炎症，脑结构和认知功能。然而，IF对糖尿病相关的认知缺陷的保护作用尚不清楚，在很大程度上未充分了解肠道菌群对脑功能的影响。
结果
1 IF抑制胰岛素抵抗和认知障碍
三个月大的db/db小鼠被给予ad libitum饮食或者每隔28天禁食24h（Fig.1a）。与db/m组相比，同窝的正常组小鼠，在db/db小鼠中食物/能量的摄取是更高的（Fig.1c,1d）（采用Tukey’s 检验的ANOVA, p<0.01）。IF在不改变全部能量摄取的情况下减轻了db/db小鼠的体重（Fig.1b）（采用Tukey’s 检验的ANOVA, p<0.01）。此外，在此疗法结束时，IF处理大大地减少了db/db小鼠每天的摄水量和尿量（补充Fig.1A）（Tukey’s 检验的ANOVA,p<0.01）。
在第28天，通过胰岛素耐受试验评估IF在db / db小鼠中对胰岛素抵抗的影响（图1e）。具体而言，与ad libitum饮食的小鼠相比，IF处理通过抑制空腹血糖水平（降低54.8％）和空腹胰岛素水平（降低29.8％）来提高db / db小鼠的胰岛素敏感性（图1f，g）。 db / db小鼠经IF治疗后，反映胰岛素抵抗的HOMA-IR值降低（图1h）。此外，IF有意地减少了附睾白色脂肪组织（eWAT）的质量和脂肪细胞的大小（补充图1B–D）（采用Tukey检验的ANOVA，p <0.01）。进行Morris water-maze迷宫测试以评估IF对糖尿病小鼠固有的认知障碍的影响。在5天的导航测试中，IF降低了逃跑潜伏期，表明db / db小鼠的认知能力得到改善（图1i；补充图1E）。在探查试验的当天，IF提高了了db / db小鼠在靶标象限中（采用Tukey的ANOVA检验，p <0.05）花费的时间，这反映了糖尿病小鼠的空间记忆增加（图1j）。高架迷宫（一种焦虑行为测试）的结果表明，IF治疗可改善db / db小鼠的焦虑行为和自主活动能力（补充图1F–H）。
图1. db / db小鼠的间歇性禁食减轻了胰岛素抵抗和认知障碍。 a描绘每组IF或ad libitum的时间轴； b体重（每组n ＝ 10只小鼠）； c能量摄入； d食物摄入； e胰岛素耐受性测试； f空腹血糖； g空腹胰岛素水平（每组n = 7只小鼠）； h HOMA-IR（每组n = 7只小鼠）。
2 IF改善了神经突触的超微结构和胰岛素信号
海马区是大脑主要的认知和记忆有关的功能区，因此海马区中神经突触的超微结构是被检测的。一项突触后密度（PSD）（图2a）的分析揭示了与db/db组相比，db/db-IF组小鼠的PSD的长度和宽度均增加了（图2b,c）（采用Tukey检验的ANOVA，p <0.01）。
在海马区中对胰岛素信号进行评估，为了评估IF是否可以改善脑胰岛素抵抗。 IF增加了IRS1-Tyr896 /IRS1和Akt的磷酸化，表明它激活了海马区中胰岛素信号通路（图2d）。我们还观察到，与db / db小鼠相比，IF治疗增强了BDNF（一种参与维持神经元存活和突触功能的神经营养因子）的表达，并增强ERK / CREB的磷酸化（BDNF合成的上游信号）（图2e）。（采用Tukey检验的ANOVA分析，p <0.05）。同样地，在IF处理的小鼠的海马区中，兴奋性突触后密集区中的一种支架蛋白PSD-95的表达也增加了（图2e），这与PSD超微结构的改变相一致。
还值得注意的是，NFκB作为主要的介导炎症性转录因子，在糖尿病小鼠的海马中被激活（补充图2）。 IF处理抑制了NFκB的活化，并下调了JNK / p38的磷酸化和Iba-1的蛋白表达，Iba-1是小胶质细胞活化的众所周知的标志物（补充图2）。
图2 间歇性禁食改善了db / db小鼠大脑中的突触超微结构，并改变了IRS / Akt和CREB / ERK信号传导。 a突触超微结构的代表图像。 b，c PSD的长度和宽度（每组n = 6个切片）。 d，e海马区IRS / Akt和CREB / ERK相关信号的蛋白质印迹分析（每组n = 3只小鼠）。
3 IF改善了海马区中线粒体的生物发生
为了确定海马区中IF调控的关键生物学过程和途径，对小鼠海马区进行了RNA测序（补充数据1）。对所有小鼠进行了310.85 Gb cleanRNA-SEQ做小家鼠基因组作图后，我们采用FPKM值检测到27,094个基因（包括1345个没有注释的新预测基因）（补充数据2）。其中，使用差异表达基因（DEG）分析（DEG-group 1基因），与db / db和db / m小鼠相比，发现db / db-IF小鼠中有1181个基因高表达（FDR-p <0.05）（图3a；补充数据3），其中大多数富含线粒体相关的GO关系分析。对在db / db小鼠中低表达的那些基因（DEG-group 6基因）的GO关系分析表明，db / db小鼠的呼吸链和线粒体裂变/翻译生物学过程是失调的，这提示了糖尿病小鼠海马区中线粒体的代谢异常。然而，与线粒体相关基因表达有关的调控是通过IF疗法得到了纠正（图3a）。此外，经IF处理后，db / db小鼠海马区中483个基因的表达（DEG-第3组和第6组）与db / m小鼠中的水平相当（FDR-p <0.05），甚至其中31.3％的基因比db / m小鼠中的表达量更高（60个基因）或更低（91个基因）（补充数据3）。 IF还通过上调线粒体相关基因的表达而提高了与氧化磷酸化（OXPHOS）通路有关的KEGG途径中的相关基因的表达（图3b）。对这些基因的KEGG分析还表明，IF处理改善了db / db小鼠中被下调的涉及OXPHOS中与能量代谢相关的基因表达（补充图3B）。
为了证明被IF疗法影响的生物网络，我们用了31个样本里的全部的27094个基因做了加权基因共表达分析（WGCNA）并且有5大模块是被确认了在功能上和生物学上都有联系的基因（补充数据图3c）。值得注意的是，“MEbown”模块与IF疗法高度正相关（r = 0.892, p = 2e-11）（补充数据图3D），这由DEG证实的1044个基因（88.4%）所组成（补充数据图3E）。我们证实了49个hub基因(FDR-p < 0.01)在模块中的高度互联互通（补充数据图3E）。更重要的是，已证实的hub基因中的大多数是在GO terms中与线粒体代谢相关富含，并且在KEGG通路中与氧化磷酸化，Huntington氏舞蹈症，AD,帕金森病有关（图3C,D;补充数据5）与RNA测序分析结果相一致，qPCR分析证实了在db / db小鼠中表达的线粒体和代谢基因被IF上调（补充图3F）。作为线粒体生物发生的指标，db / db小鼠的海马区中mtDNA / nDNA比值被IF升高（图3g）（采用Tukey检验的ANOVA，p <0.01），表明线粒体基因上调可能是线粒体质量增加的结果。
然后，我们试图检查PGC1α和AMPK / mTOR蛋白的表达，以揭示db / db-IF组中线粒体生物发生上调的潜在机制（图3e）。 IF导致线粒体生物发生的主要调节子PGC1α蛋白表达的显著增加；这与线粒体相关基因的上调建立了强烈的相关性（补充图3F）。与先前的研究一致，IF增加了AMPK的活化，该激酶对禁食状态下细胞能量代谢敏感（图3e），并抑制了mTOR的磷酸化，mTOR是一种真核细胞营养传感器，在调节线粒体质量控制和OXPHOS过程中起着至关重要的作用。
图3 间歇性禁食改善了海马区的能量代谢和线粒体的生物发生。
4 IF重塑了肠道菌群和菌群代谢物
肠屏障的完整性对于维持肠通透性和预防内毒素血症至关重要，并且还与糖尿病及其并发症相关。也有报道说，肠道通透性增加会增加内毒素血症，从而加剧炎症，进而触发葡萄糖耐量受损。因此，我们通过评估绒毛长度，肌层厚度和杯状细胞数量，研究了IF对肠屏障完整性的影响。结果表明，IF增加了糖尿病小鼠的绒毛长度和肌层厚度，但对杯状细胞的数量没有影响（补充图4A-D）。此外，使用Ussing Chamber评估了结肠的通透性，我们观察到IF阻止了肠泄漏并伴随血浆中LPS水平的下降（补充图4G，H）（采用Tukey检验的ANOVA，p <0.01）。肠屏障中的紧密连接蛋白claudin-1的表达在db / db-IF结肠组织中也有所升高（补充图4A，E，F），这与肠道通透性的改变相一致。
在第0天（基线水平）和第28天，使用细菌16S rRNA基因v3-v4扩增子测序检测各自小鼠的粪便样本中的肠道菌群组成。具体而言，虽然OTU的总数仍然保持在最初的相同水平上，但α多样性在经过28天的IF处理后显著性增加（图4a）（Kruskal–Wallis，p <0.05）。 db / db-IF小鼠在第28天的未加权Unifrac距离与其他组不同，这表明IF疗法同时改变了β多样性（图4b）（p <0.05）。考虑到时间作为一个影响背景，不同的饮食和鼠的基因型是肠道微生物组塑形的主要因素，分别解释了总变异的5.9％和7.7％（图4c）。IF处理并不能完全抵消糖尿病的影响，Allobaculum和 Bifidobacterium的相对丰度在db / db小鼠中均减少（图4d）。然而，IF处理改善了Lactobacillus和丙酸盐产生菌 Odoribacter的丰度，同时Enterococcus, Streptococcus和 unknown Enterococcaceae是减少的（图4d；补充数据6）（ANCOM，p <0.05）。与db / db组相比，在db / m和db / db-IF组中，来自Candidatus Arthromitus, Rummeliibacillus, unknown Enterococcaceae和 Leuconostocaceae的细菌均较低（图4d）。
此外，经确定的IF相关的属与肥胖和认知相关的血糖和体重相联系。具体而言，Candidatus Arthromitus和an unknown Leucostocaceae属与血糖呈正相关（(Pearson相关系数分别为0.52和0.72，p <0.05）。 unknown Enterococcaceae与体重呈正相关（Pearson相关系数= 0.59，p <0.05）（补充图5B，补充数据7）。
考虑到小鼠基因类型的影响，我们在第28天评估了db / db组和db / db-IF组小鼠的肠道菌群组成。我们发现总共有17个受IF影响的zOTUs，其中5个属于Lactobacillus（图4e）。同时，PICRUSt分析揭示了11种不同丰富的KEGG基因通路（FDR-p <0.1）。其中，在db / db-IF组中初级和次级胆汁酸的生物合成丰富（图4f；补充数据8）。
IF处理对肠道菌群产生了巨大影响，研究它是否以及如何影响循环中的微生物代谢产物以及其水平是否主要受肠道菌群的调节这引起了我们的兴趣。这项研究可以提供有关IF处理对宿主代谢益处潜在机制的新见解。总体而言，在经IF处理28天后的db / db小鼠，血浆样品的非目标性代谢物谱分析显示，许多代谢物发生了明显变化（补充图5C，D）。分别从从反相色谱的正极（RP+）和负极（RP-）采集的数据集来看，代谢物特征的数量在不同的处理方式中不同，分别为5604和5230中的540和491（补充图5E，F）（FDR-p ＜0.05）。特别强调了预先确定的、其水平主要由肠道菌群的丰富度来调节的23种微生物代谢产物的子集，（补充数据9）来证明IF处理，肠道菌群和代谢组之间的直接联系。在这些代谢产物中，与ad libitum的db / db小鼠相比（Wilcoxon秩和检验，p <0.05），IF增加了血浆中5-HT，色氨酸，对羟基苯乙酸，N-乙酰基色氨酸，肉桂酰甘氨酸，IPA和胆汁酸的水平，例如胆酸（CA），脱氧胆酸（DCA），鼠李酸（MCA）和TUDCA。相反，db / db-IF组的酪氨酸，苯基乙酰基甘氨酸，苯基丙酰甘氨酸，磷酸甲酚和对甲酚硫酸盐以及12-羟基二十碳五烯酸（12-HEPE）的水平低于db / db组（图4g）。（Wilcoxon秩和检验，p ＜0.05）。
此外，我们还分析了粪便样品中短链脂肪酸（SCFA）的浓度，这已证明可以保护肠屏障功能和调节胰岛素敏感性。经过28天的处理，IF改善了db / db小鼠的乙酸盐，丙酸盐和丁酸盐水平（补充图4I–K）（采用Tukey检验的ANOVA，p <0.05）。应当指出，血浆中的SCFA浓度很低，因此在当前环境中使用非目标性的代谢组学无法准确检测到。
图4. 间歇性禁食治疗的db/db小鼠的肠道菌群和血浆代谢组学分析。
5 IF疗法的综合多组学分析
在确定了IF在糖尿病小鼠中上调或下调的不同组学特征后，下一步是评估海马区基因表达（图3），肠道菌群组成（图4）和微生物代谢产物（图4）之间的相互作用。与IF处理对小鼠认知缺陷观察到的影响相联系（图2）。多OMICs数据集是用一个潜在元件方法（DIABLO），整合使用数据对生物标志物的挖掘做综合性分析。DIABLO是一种多元降维判别分析的方法，旨在从各种OMIC技术中识别出生物学相关和高度相关的特征（图5；补充信息）。
在进行多OMICS整合之前，我们首先评估了IF上调的枢纽（hub）基因 n = 36，IF改变的OTUs（n = 17），预先确定的血浆微生物代谢产物（n = 23）和三个粪便SCFAs，即乙酸盐，丁酸盐和丙酸盐可以在一个多变量的方式上预测小鼠的IF状态。预测建模是通过将部分最小二乘判别分析并入重复的双重交叉验证框架（rdCV-PLSDA）中进行的，从而有效地降低了统计的拟合风险。在db / db和db / db-IF小鼠之间实现了显著分离，枢纽（hub）基因，OTUs和代谢物的预测准确度分别为100％，90％和95％（图5a）。对于每个OMIC数据集，最佳的选择数潜在组件为1。构造模型的预测能力优于1000个排列模型，证明了预测模型在使用具有极简洁性的OMIC集的普遍性特征将db / db从db / db-IF中区分开来的稳健性和有效性（Student's t检验，p <0.05 ，补充图6B）。
综合模型是在多OMICs特征和一个包含来自于每一个OMICs数据集的10个关键预测因子的潜在成分中所进行的，这造成了db / db和db / db-IF之间的巨大间隔（图5b）。最佳选择的关键预测因子包括几种肠道菌群，即Lactobacillus, Bacteroides, 和 Facklamia, 微生物代谢物，如胆汁酸，IPA，5-HT，色氨酸，羟基色酚和硫酸吲哚酚，以及富含线粒体，核糖体的基因或与代谢相关的GO分析（图5b，c；补充图6C）。关键预测因子也是高度相关的（图5d）。
图5 IF处理相关的一体化建模策略和性能的多OMICS。
6 IF的有益作用需要肠道菌群
为了证明肠道菌群在介导固有糖尿病认知缺陷中的关键作用，我们试图调查在db / db小鼠中去除肠道菌群后，IF的观察到的有益作用是否会受到影响。
应用抗生素混合物处理以建立微生物群在IF提供的神经保护中的作用。在4周IF疗法之前的14天以及整个实验中，在饮用水中给小鼠使用抗生素，并在28天后评估行为改变（补充图8A，B）。抗生素处理削弱了IF处理的减肥效果（图6a）（采用Tukey检验的ANOVA，p <0.05）。抗生素处理对eWAT的重量没有影响，但会增加肝脏和盲肠的重量（补充图8E–G）。IF和抗生素处理都减少了db / db小鼠的摄食量和摄水量（补充图8C，D）。但是，口服抗生素对IF在胰岛素抵抗的有益作用上没有影响（补充图8H-K）。值得注意的是，通过Morris水迷宫测试评估发现，与IF相关的认知能力的改善在经抗生素处理后而被部分抵消，在测试的第5天伴随有一个更长的逃跑时间并且在探查测试日的目标象限中更低的逃逸时间（补充图） 6B;图8L，M）。此外，在db / db-IF小鼠中抗生素处理废除了线粒体生物发生的上调（图6c）。对PSD的分析（图6d，e）显示，通过抗生素处理，db / db-IF小鼠的PSD宽度减小了（采用Tukey检验的ANOVA，p <0.01）。这些结果共同表明，肠道菌群的移除部分地废除了IF对认知功能的保护作用。
另外，与db / db-IF组相比，我们发现通过抗生素处理移除肠道菌群，可显著降低db / db小鼠血浆中IPA的水平和粪便中SCFAs水平（补充图9，补充数据10）（采用Tukey检验的ANOVA，p <0.01）。
图6 抗生素和微生物代谢产物对经IF处理的db / db小鼠认知功能的影响。
7 肠道菌群代谢物改善了认知功能
讨论
大量研究表明，IF通过重塑肠道菌群对糖尿病及其并发症发挥有益作用。但是，IF是否可以缓解糖尿病相关的认知缺陷以及在肠道菌群中所起的作用仍不清楚，这就迫切需要对IF是如何改善认知功能的潜在机制作研究。这项研究通过对糖尿病小鼠行为/突触结构，线粒体/能量代谢相关信号的全面研究，以及对多个OMICs的整合分析首次证明了28天的IF处理可通过微生物-代谢物-脑轴减轻糖尿病诱发的认知障碍。
一个实际标准有效的认知评估，从Morris water-maze测试结果来看，IF改善了糖尿病小鼠的认知功能和空间记忆。我们先前的研究发现，脑胰岛素信号转导的受损会导致葡萄糖基础代谢减慢，三羧酸（TCA）紊乱，以及神经递质水平的改变和长期的下降增强趋势（LTP）。这一发现提供了脑能量代谢与认知功能之间的重要联系。在这里，我们发现IF刺激了IRS1 / Akt信号及其相关的ERK / CREB / BDNF神经营养信号，而且IF抑制了NFκB/ JNK炎症通路（图2；补充图2）。一致地，突触后蛋白PSD-95的增加和海马突触超微结构的改善进一步证明了IF疗法对突触功能的益处。需要分别通过PET / CT / NMR和LTP分析测量来确定IF对糖尿病模型中神经元葡萄糖摄取/代谢和突触传递的影响。
对多OMICs数据集的综合分析显示，循环中肠道菌群代谢产物的变化与IF诱导的微生物组的变化以及海马区线粒体和能量代谢相关基因表达的变化之间存在着密切联系。这些发现表明，28天的IF通过肠-代谢-脑轴对糖尿病诱导的认知功能产生有益作用（图5），据我们所知，这尚未见报道。
在本文中，我们观察到28天的IF疗法可改善肠屏障完整性并降低血浆LPS水平，这可以部分地解释IF是如何减少神经炎症反应的。 IF还改变了糖尿病小鼠的肠道菌群多样性，并伴随着菌群丰度的改变，增加了Lactobacillus的丰度（图4）。 IF对肠道菌群的影响已有大量的报道。但是，由于动物品系，饲养条件，基线菌群分布和进食期的差异，IF对肠道菌群的重塑作用可能有所不同。李等人的报道说，每隔一天的禁食养生法增加了雄性C57BL / 6N小鼠粪便中Firmicutes的OTU丰度，同时降低了粪便中其他门类菌的含量。 IF还丰富了隔日饲喂的雌性C57BL / 6J粪便样中的Lactobacillaceae, Bacteroidaceae和 Prevotellaceae科的含量。有趣的是，最近进行的一项IF 对db / db小鼠粪便肠道菌群组成的研究发现，7个月的IF疗法可丰富Lactobacillus的含量和减少Akkermansia的含量，这与我们的发现是相一致的。
IF重塑的肠道菌群导致血浆中肠道菌群代谢物的改变，这可能进一步解释了IF是如何减轻糖尿病小鼠的认知障碍的。 PICRUSt分析发现，IF疗法后，包括一级/二级胆汁酸生物合成在内的几种微生物相关的代谢途径发生了改变（图4f）。然而，PICRUSt本身是具有缺陷的，由于适当的参考基因组的有效性以及由于菌株变异而无法检测到在16S rRNA序列上的菌株变异。在这项研究中，使用代谢组学分析，我们发现IF会增加血浆中包括CA，TUDCA，MCA和DCA在内的BAs的水平，并且这些BAs与IF影响的肠道菌群和海马区的转录组有关。而且，口服TUDCA还改善了db / db小鼠的认知障碍（图6）。这些发现表明，BAs通过肠道菌群-代谢物-脑轴在糖尿病小鼠的认知障碍中扮演重要作用。根据我们的研究，长期IF处理可通过改善血浆TUDCA预防糖尿病微血管并发症。饮食引起的BA合成失调与神经可塑性受损有关。一项最新的人体研究还报道了BA与认知功能之间有很强的联系，血浆中CA的浓度降低与AD发展进程相关。另外，BA稳态对于正常的葡萄糖/脂质稳态是必不可少的，这可能部分地解释了为什么能量代谢相关基因在db / db-IF组中高表达。
在db / db小鼠中通过IF处理改变的其他重要微生物代谢物包括色氨酸及其代谢物5-HT和IPA。色氨酸不仅是蛋白质合成所必需的氨基酸，而且还是许多神经保护代谢物的前体。肠道菌群在调节5-HT的合成中起着关键作用，5-HT是调节情绪和认知的众所周知的肠脑轴的关键激素/神经递质。有趣的是，我们发现IF可增加db / db小鼠的5-HT水平并抑制焦虑（图1f–h；补充图4G）。我们发现，IF疗法使Lactobacillus，5-HT以及海马基因的表达丰富，支持先前报道过的乳杆菌属对神经末梢5-HT合成的影响并缓解行为障碍（图5）。此外，IPA是色氨酸的一种微生物脱氨代谢产物，是一种有效的神经保护性抗氧化剂。在最近的一项研究中，血浆较高的IPA浓度与较低的2型糖尿病的发病风险相关。它在预防神经元损伤中的作用也已广为报道。一致地，我们还发现IPA和5-HT治疗可显着减轻糖尿病小鼠的认知功能障碍（图6）。综上所述，我们的发现IF疗法可通过重塑肠道菌群和代谢产物来改善脑能量代谢和认知功能。
值得注意的是，这些经IF改善的神经保护性肠道菌群代谢产物与海马区的线粒体生物发生和能量代谢相关的基因表达高度相关，这可能为IF如何减轻糖尿病引起的认知功能障碍提供了新机制（图5）。线粒体作为真核细胞的能量来源，通过OXPHOS生成ATP以满足神经元对能量的巨大需求。需要足够的能量供应来维持神经元存活，神经传递和突触功能。禁食过程还触发了AMPK的激活和mTOR的失活，随后刺激能量代谢并上调线粒体功能以满足能量缺乏症。我们发现IF改善了线粒体的生物发生和能量代谢相关通路，与蛋白质水平上的AMPK /PGC1α通路的上调相一致（图3）。此外，已经很多报道关于菌群代谢产物，即5-HT，TUDCA和IPA有益于线粒体的生物发生和功能。据报道5-HT可以预防多巴胺诱导的线粒体和突触小体的氧化损伤。如前所述，TUDCA是潜在的神经保护剂。也有报道说，在IPA诱发的Huntington病模型中，TUDCA治疗可通过改善线粒体功能和减少神经元凋亡来避免认知功能障碍。同样，IPA作为一种菌群代谢产物，可以防止Aβ诱导的神经元死亡并恢复线粒体功能。肠道微生物对膳食纤维降解产生的SCFAs被广泛研究为对大脑健康的潜在益处。例如，丁酸盐作为自闭症谱系障碍的一种潜在的治疗方法而被发现，因为它具有增强线粒体功能的生物活性。因此，我们还发现肠道菌群代谢物的处理也改善了糖尿病相关的认知障碍并增加了线粒体的生物发生（图6）。
此外，在通过抗生素处理消除糖尿病小鼠的肠道菌群后，IF对认知功能的有益作用被抑制（图6），这表明肠道菌群组成及其衍生的代谢产物在介导IF诱导的神经元作用中发挥着关键性作用。 IF处理的小鼠中，线粒体的生物发生也被抗生素所下调，而这进一步证实了肠道菌群重塑与海马区线粒体基因表达高度相关。尽管有一些报道表明甲硝唑可以穿越血脑屏障并具有潜在的神经毒性。但是，在抗生素处理后，我们在db / m和db / db小鼠中均未观察到任何行为障碍（图6；补充图7）。值得注意的是，单独的抗生素处理研究也部分地改变了db / db小鼠的食物/水摄入量，胰岛素抵抗和认知行为（图6；补充图8），这与先前的报道表明甲硝唑或万古霉素治疗可改善脑胰岛素敏感性和行为有关。肥胖和糖尿病小鼠的变化56。此外，在IF处理的db / db小鼠中，抗生素处理减少了SCFA和IPA的生成，但未降低TUDCA和5-HT的水平（补充图9）。这些结果表明， IF疗法和抗生素联合应用的有效性在代谢综合征中需要进一步被研究。进一步研究将肠道菌群变化传递到大脑的分子和信号途径也很重要，这可能会导致对代谢相关的认知功能障碍的新的治疗靶点的发现。
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